摘要：

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)正變得越來越廣泛，特別是在農(nóng)藝領(lǐng)域，植物功能基因的分離大量的應(yīng)用了該技術(shù)。未來的研究將探索分子標(biāo)記技術(shù)的新應(yīng)用，并使分子標(biāo)記技術(shù)更加全面?；蚴钱a(chǎn)生特定蛋白質(zhì)的DNA序列，功能基因的分離有重要意義，本文綜述了植物種群的分離，DNA文庫的構(gòu)建，基因庫的構(gòu)建，靶基因的分離和鑒定，以及基于DNA分子標(biāo)記的植物功能基因的分離。

關(guān)鍵詞：

分子標(biāo)記；植物功能基因；基因分離

中圖分類號：Q7

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：1019754/jnyyjs20190315012

前言

分離基因主要有正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑2種不同的途徑。其中正向遺傳學(xué)就是依靠目的基因本身所具備的功能鑒定基礎(chǔ)之上對產(chǎn)物或者是某種表型突變來進行鑒定；后者通過基因組中的特定序列或位置集中于基因本身。傳統(tǒng)的功能性克隆是基于已知基因的產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)其核苷酸序列，然后基于該序列設(shè)計探針或引物以篩選來自eDNA文庫或基因組文庫的克隆，屬于前一類[1]。而先找到與靶基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記，然后通過“行走”或“著陸”染色體克隆靶基因的方式屬于反向遺傳學(xué)即第2類。

1DNA分子標(biāo)記在植物上的應(yīng)用

有許多具有獨特用途的分子標(biāo)記，并且已經(jīng)提出了植物中分子標(biāo)記組合的實例。而分析標(biāo)記概念從狹義角度上來講就是DNA標(biāo)記，可以對生物體或者是群體基因組中的一些差異DNA片段進行反應(yīng)，分子標(biāo)記概念能夠很好的對基因組DNA之間的差異進行反應(yīng)，其中一些非常常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。其中的EST是在mRNA的基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記。具體如下所示。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)與分子生物學(xué)的發(fā)展密切相關(guān)。由于DNA核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA重組技術(shù)，基因定位突變，聚合酶鏈反應(yīng)，DNA限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（Ran2），建立隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）和蛋白質(zhì)工程，以制定分子生物學(xué)研究成果遺傳學(xué)的理論研究和生物技術(shù)實際應(yīng)用的各個方面正發(fā)揮著巨大的作用[3]。

2植物功能基因的分離策略

植物基因組DNA育種的特殊遺傳群體是篩選與靶基因密切相關(guān)的分子標(biāo)記的關(guān)鍵步驟。靶基因必須滿足一些基本的條件：除了其所在基因組的局部區(qū)域外，基因組DNA序列的其余部分是相同的，并且在這些材料之間發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性標(biāo)記可以與靶基因緊密連鎖。靶基因的近等基因系（NIL）是一組合格的物種，鑒于NIL的遺傳組成，可能在近等基因系之間顯示多態(tài)性的分子標(biāo)記可能位于靶基因的2個翼附近。

21植物基因組DNA的提取方法

植物功能基因的提取是在基因?qū)用娴牟僮?，現(xiàn)已在一定程度上有了較為成熟的方法，基因組DNA的提取是DNA分子標(biāo)記的前提，只有將基因組的DNA提取出來了，才能對DNA分子進一步進行標(biāo)記操作，才能使功能基因得到分離。在植物基因組DNA的提取技術(shù)上，科研工作者也做出了較多的努力，取得了較多的成果，較為成熟的方法也形成了一定的體系[4]。常見的DNA提取方法有：sDs法口；改良的SDS法；常規(guī)的CTAB法；高鹽CTAB法；改良的CTAB法。

22 DNA分子標(biāo)記方法

DNA分子標(biāo)記是指通過DNA分子水平的技術(shù)和方法鑒定生物體之間的不同DNA片段作為遺傳標(biāo)記。其中可以將DNA分子按照標(biāo)記方法的不同分為基于分子雜交的多態(tài)性比如說RFLP（Re—strietion Fragment Lensth Polymorphism），以及基于PCR反應(yīng)的多態(tài)性如RAPD、SSR、AFLP、AP—PCR、DAF等共有2種標(biāo)記類型。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，其中DNA聚合酶使用2個寡核苷酸作為引物來催化位于2個引物中的DNA片段的擴增。DNA分子標(biāo)記技術(shù)本身是一種非常有效的手段在基因定位中應(yīng)用非常廣泛，而且在新階段的基因分離和品種改良研究分析過程中也會起到一定的作用。隨機擴增多態(tài)性DNA隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplifi，edPolymorphic DNA，RAPD）是由Wil—liams（1990年）和Welsh（1990年）各自獨立提出的一種DNA多態(tài)性檢測技術(shù)[5]。大量研究表明，SSR分子標(biāo)記具有簡單，穩(wěn)定和良好的多態(tài)性。使用SSR標(biāo)記的前提是理解重復(fù)序列側(cè)翼的DNA序列，這使得該技術(shù)在應(yīng)用上受到限制，但近年來這一進展迅速。

DNA分子標(biāo)記的方式，主要包含了以下一些基本的操作：分離大片段陽性克隆的左端和右端，之后需要將其作為探針對基因組文庫進行再次的篩選，所獲得的新克隆則是沿著染色體的一種進步和發(fā)展。在染色體行走過程中所需要面臨的主要問題就是一旦需要對一些無法克隆的片段進行傳遞時，就會使得步行過程出現(xiàn)中斷現(xiàn)象。但在不斷的研究過程中，發(fā)現(xiàn)可以通過染色體跳躍和連接等方法解決以上問題。而跳躍文庫和連接庫的構(gòu)建主要由具有少量識別位點和大量識別位點2種不同的酶來完成的。其中skip文庫的插入物是從同一文庫中大片段克隆的雙消化部分。一些具備的切割點的酶產(chǎn)生了連接文庫的插入物，這些擦入物具備酶識別位點并且切割點較少。為能夠進一步向靶基因靠近，可以將染色體步移中的跳躍以及結(jié)扎過程由2個文庫交替來完成。

3結(jié)束語

現(xiàn)科學(xué)研究中已經(jīng)利用DNA分子編輯實現(xiàn)了大量的植物功能基因的分離，隨著科技研究的發(fā)展，隨著各個領(lǐng)域的分子學(xué)水平的提高，該技術(shù)在基因分離上展示出了巨大的潛力和光明的前景。但是，中國與國際領(lǐng)先水平之間仍存在較大差距。推廣其應(yīng)用，利用先進的科技水平為人類的生活水平的提高帶來益處。[JP]

參考文獻

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華麗霞，何煉，蔣秋平，等.稻瘟病抗性基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用進展[J].分子植物育種，2016，14（10）：2739-2748.

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[4] 馮尚國，朱宇佳，焦凱麗，等.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在酸漿屬藥用植物中的應(yīng)用研究[J].中國中藥雜志，2018（4）：672-675.

[5] 劉立敏，韓多，李海峰，等.HPLC含量測定和DNA分子標(biāo)記技術(shù)對重樓屬藥用植物的鑒定[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017（2）：355-359.

作者簡介：

程曼（1987-），女，中級職稱，山東，碩士研究生，研究方向：花卉組培及基因編輯。