暴曉博,任 軍,王玉鳳,賈凌云*

(1. 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116023;2. 康元醫(yī)療科技(大連)有限公司, 遼寧 大連 116000)

腎臟病是嚴(yán)重危害人類健康的重大慢性疾病。相關(guān)流行病學(xué)資料顯示,我國人群中慢性腎臟病(CKD)的發(fā)生率約為11%～13%[1]。透析相關(guān)淀粉樣變是經(jīng)過長期透析治療的腎病患者常見的并發(fā)癥。該癥主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的淀粉樣沉積,導(dǎo)致骨和關(guān)節(jié)的致殘性病變[2]。該并發(fā)癥的發(fā)病率隨透析年齡和患者年齡增長而增加。淀粉樣物質(zhì)還可以沉積于消化道和心血管,引起吞咽痛、消化道出血、腸梗阻和心肌淀粉樣變,嚴(yán)重者可死于充血性心力衰竭。

血液中β2微球蛋白(beta-2-microglobulin, B2M)的水平升高導(dǎo)致的淀粉樣沉積是透析相關(guān)淀粉樣變的顯著特征[3]。B2M是1968年瑞典Berrgard等[4]首先從腎小管蛋白尿中分離發(fā)現(xiàn)的由100個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽,相對(duì)分子質(zhì)量為11.8 kDa。在健康人體內(nèi)B2M以相對(duì)穩(wěn)定的速率合成和代謝,血清中的含量一般為1.5～3 mg/L[5]。腎病患者由于腎臟功能受損,導(dǎo)致體內(nèi)生成的B2M無法代謝,而常規(guī)透析等手段很難去除B2M這種中分子物質(zhì)[6],長期透析的腎病病人血清中的B2M含量可以達(dá)到20～50 mg/L,血清中高濃度的B2M導(dǎo)致透析相關(guān)淀粉樣變的發(fā)生。因此,研究B2M單體的聚集過程對(duì)于預(yù)防和治療透析相關(guān)淀粉樣變具有重要的意義[7]。此外,對(duì)B2M的透析過濾效果也是表征高通量血液透析器毒素透過性能的重要質(zhì)量指標(biāo)之一。上述兩方面的應(yīng)用需求都對(duì)B2M標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量提出了較高的要求。

評(píng)估血液透析器的透過效率需要使用B2M作為標(biāo)志物,使用商業(yè)化的B2M試劑盒(通過抗原抗體結(jié)合的原理進(jìn)行檢測[8,9])檢測透析前后血漿中的B2M濃度來計(jì)算透過效率。由于B2M具有較強(qiáng)的疏水性,在制備和儲(chǔ)存的過程中容易形成二聚體。當(dāng)使用的B2M標(biāo)準(zhǔn)品中有B2M二聚體存在時(shí),由于B2M二聚體相比B2M單體更不易透過血液透析膜,導(dǎo)致對(duì)透過效率評(píng)價(jià)結(jié)果的可信度下降。因此,有必要建立B2M標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)過程中單體含量的分析方法。

目前,B2M有腎臟病人尿液中提取和基因重組表達(dá)兩種來源。由于在產(chǎn)量和生產(chǎn)成本上的優(yōu)勢,市場上B2M產(chǎn)品多通過基因重組表達(dá)獲得[10-12]。B2M標(biāo)準(zhǔn)品純度的檢測采用基于抗體抗原特異性識(shí)別的免疫比濁法,該類檢測試劑盒測定的是B2M總量,很難區(qū)分出單體、二聚體及多聚體。且市售的試劑盒主要用于臨床診斷,其檢測方法的線性范圍遠(yuǎn)小于產(chǎn)品質(zhì)控中常用的濃度范圍[13,14]。因此,建立一種針對(duì)B2M標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)過程中單體和聚集體的快速準(zhǔn)確定量方法對(duì)于B2M的生產(chǎn)及質(zhì)控具有重要意義。凝膠過濾色譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)性過程中聚集體與蛋白質(zhì)單體的分析[15,16],選擇合適的凝膠過濾色譜條件可以實(shí)現(xiàn)對(duì)B2M單體的定性定量檢測。

本研究通過凝膠篩分高效液相色譜建立了B2M單體的定量檢測方法,并對(duì)方法的精確度和穩(wěn)定性加以驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜Agilent 1200 Series(美國Agilent Technologies);凝膠篩分色譜柱:TSKgel SuperSW2000(30 cm×4.6 mm, 4 μm,日本Tosoh Bioscience); Millipore Elix20超純水系統(tǒng)(美國Millipore);精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

特定蛋白質(zhì)分析儀及配套B2M免疫比濁檢測試劑盒(石家莊禾柏科技有限公司)。20×磷酸緩沖液(PBS, 0.2 mol/L, pH 7.2～7.4)、Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 單體B2M和二聚體B2M的制備

構(gòu)建了B2M的重組表達(dá)載體B2M-pET23a,并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)獲得的B2M包涵體進(jìn)行了復(fù)性。復(fù)性后的B2M使用AKTA-Purifer100通過Q-Sepharose強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)純化。使用0.01 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液上樣。B2M單體洗脫條件:0.1 mol/L NaCl, 0.01 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液。B2M二聚體洗脫條件:0.3 mol/L NaCl, 0.01 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液。檢測波長為280 nm。

收集不同條件下的洗脫峰,使用非還原十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)初步檢測其純度。單體B2M超濾換液至超純水中,冷凍干燥制成干粉保存。二聚體B2M超濾換液至超純水中,于-20 ℃冷凍保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制

1×PBS的制備:20×PBS(pH=7.4)與超純水按照體積比1∶19的比例混合,混合后經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾,高溫滅菌,超聲除氣處理。

使用精密分析天平稱取10.0 mg單體B2M干粉,加入20 mL 1×PBS中,充分溶解制成B2M質(zhì)量濃度為0.50 g/L的蛋白質(zhì)溶液,使用B2M免疫比濁檢測試劑盒測定溶液中B2M的濃度,測定結(jié)果應(yīng)與理論值誤差小于10%。

1.4 色譜條件

凝膠篩分柱:TSKgel SuperSW2000;柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:1×PBS;進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.5 mL/min;紫外檢測波長:280 nm。

1.5 凝膠過濾液相色譜對(duì)B2M的定性分析

使用非還原SDS-PAGE檢測標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白溶液和二聚體樣品的純度。使用Bradford試劑盒測定二聚體樣品中總蛋白質(zhì)濃度。將標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)溶液與二聚體溶液按體積比1∶1混合,制成混合樣品。標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)溶液、二聚體蛋白質(zhì)溶液、混合樣品依次經(jīng)凝膠過濾液相色譜進(jìn)行樣品純度檢測。

1.6 B2M單體定量檢測方法的建立

1.6.1B2M標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍及定量限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液用1×PBS逐級(jí)稀釋,在設(shè)定的色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積(y)為縱坐標(biāo),B2M的質(zhì)量濃度(x, g/L)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。定量限以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算。

1.6.2檢測方法的精密度及穩(wěn)定性

在B2M質(zhì)量濃度為0.10 g/L的PBS中添加一定質(zhì)量(0.10、0.20、0.30 mg)的B2M干粉進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算蛋白質(zhì)單體回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。每種樣品平行測定3份。

先在二聚體樣品中添加B2M干粉至終質(zhì)量濃度為0.13 g/L,在此基礎(chǔ)上繼續(xù)添加B2M干粉至終質(zhì)量濃度為0.23、0.33、0.43 g/L,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算蛋白質(zhì)單體回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。每種樣品平行測定3份。

將B2M質(zhì)量濃度為0.20 g/L的1×PBS溶液于室溫放置5 h,每隔1 h取樣,使用凝膠過濾色譜法測量蛋白質(zhì)濃度。

1.6.3凝膠過濾液相色譜法與免疫比濁試劑盒分析B2M樣品的優(yōu)勢比較

在二聚體樣品中添加一定質(zhì)量的B2M單體干粉(終濃度為0.10、0.20、0.30 g/L),分別使用凝膠過濾高效液相色譜法和免疫比濁試劑盒檢測B2M單體濃度。

圖 1 強(qiáng)陰離子交換色譜純化B2MFig. 1 Purification of beta-2-microglobulin (B2M) bystrong anion exchange chromatography Peak 1: B2M eluted by 0.1 mol/L NaCl and 0.01 mol/L Tris-HCl at pH=8.5; Peak 2: B2M eluted by 0.3 mol/L NaCl and 0.01 mol/L Tris-HCl at pH=8.5. UV 280: absorbance at 280 nm; cond: conductivity.

2 結(jié)果與討論

2.1 單體B2M和二聚體B2M的制備及檢測

為了進(jìn)一步的定性分析,需要制備高純度的單體B2M和二聚體B2M。由于B2M在大腸桿菌中基因重組表達(dá)形成包涵體,包涵體需要復(fù)性后才能得到可溶的B2M。在復(fù)性的過程中,有部分B2M會(huì)通過分子間二硫鍵形成二聚體,如圖1所示,復(fù)性后B2M與強(qiáng)陰離子交換色譜結(jié)合后,在0.1 mol/L NaCl (0.01 mol/L Tris-HCl, pH=8.5)和0.3 mol/L NaCl (0.01 mol/L Tris-HCl, pH=8.5)下洗脫收集到兩個(gè)洗脫峰。經(jīng)還原SDS-PAGE檢測,如圖2a所示,兩個(gè)洗脫峰分子量均位于B2M單體分子量附近,推測其中一個(gè)洗脫峰是分子間二硫鍵形成的二聚體,在還原電泳中由于二硫鍵被還原而表現(xiàn)為單體條帶。B2M單體和二聚體的空間結(jié)構(gòu)不同影響蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷密度,導(dǎo)致出現(xiàn)不同的洗脫條件。經(jīng)過非還原電泳檢測后,如圖2b所示,洗脫峰1的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為12 kDa,為B2M單體,純度較高。洗脫峰2主要成分相對(duì)分子質(zhì)量約為23 kDa,是B2M通過分子間二硫鍵形成的二聚體。洗脫峰2中還有少量單體和多聚體B2M存在。

圖 2 還原SDS-PAGE和非還原SDS-PAGE檢測B2M純度Fig. 2 Reduced sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and non-reduced SDS-PAGE of B2M Lane M: low relative molecular mass protein marker; lane 1: B2M before purification; lane 2: peak 1 in Fig. 1; lane 3: peak 2 in Fig. 1.

將單體B2M超濾換液到超純水中,冷凍干燥制成干粉保存。將二聚體B2M超濾換液到超純水中,-20 ℃冷凍保存。

圖 3 B2M的(a)單體、(b)二聚體及(c)兩者混合樣品的凝膠過濾色譜圖Fig. 3 Gel filtration chromatogram of B2M (a) monomer,(b) dimer, and (c) mixture of monomer and dimer

2.2 凝膠過濾液相色譜對(duì)B2M的定性分析結(jié)果

制備的單體B2M和二聚體B2M為基于凝膠過濾色譜定性分析B2M樣品奠定了基礎(chǔ)。按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行定性分析。結(jié)果如圖3a所示,B2M單體在凝膠過濾色譜上的保留時(shí)間約為12 min,峰形尖銳,無雜峰,說明制備的單體蛋白質(zhì)純度較高。而圖3b所示的B2M二聚體的保留時(shí)間約為8 min。兩種蛋白質(zhì)等體積混合后進(jìn)樣的色譜結(jié)果如圖3c所示,單體和二聚體的峰形尖銳對(duì)稱,兩峰無重疊,可以實(shí)現(xiàn)基線分離。

圖3b的結(jié)果顯示制備的二聚體B2M的純度低于單體,其中含有少量蛋白質(zhì)單體和多聚體,這與非還原電泳結(jié)果一致。二聚體中的單體蛋白質(zhì)可能是部分二聚體在保存過程中分子間二硫鍵斷裂導(dǎo)致,也可能是在純化過程中未能完全分離單體和二聚體。使用Bradford試劑盒測量二聚體溶液中的總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.47 g/L,根據(jù)吸收峰面積積分后的結(jié)果計(jì)算,二聚體溶液中的單體質(zhì)量濃度約為0.03 g/L,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用二聚體溶液進(jìn)行分析時(shí)需要將這部分單體濃度計(jì)入。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍及定量限

稱取10.0 mg單體B2M干粉,加入到20 mL的1×PBS中,充分溶解,制成B2M質(zhì)量濃度為0.50 g/L的蛋白質(zhì)溶液,使用1×PBS稀釋至B2M質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.25、0.30和0.40 g/L。不同濃度的樣品依次上樣,得到一系列B2M單體的UV280吸收峰。以積分峰面積(y)為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的B2M單體的質(zhì)量濃度(x, g/L)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。線性方程為y=29.80x+0.11,相關(guān)系數(shù)為0.994 8,線性關(guān)系良好。線性范圍為0.05～0.50 g/L,定量限為0.08 g/L。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍包含了生產(chǎn)過程中B2M常見的濃度范圍,定量限低于生產(chǎn)過程中B2M的最低濃度,可以用于生產(chǎn)過程中B2M樣品的檢測。

2.3.2精密度及穩(wěn)定性

為了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度,向1×PBS溶液和二聚體溶液中添加一定濃度的B2M單體進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每種樣品平行測定3份。進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)前,使用凝膠過濾色譜檢測加入單體干粉后的PBS溶液和二聚體溶液中B2M單體的濃度,檢測出的溶液本底測量值與根據(jù)干粉量計(jì)算出的本底添加量一致。因此在表1中只列出了溶液的本底測量值。加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果表明,B2M的平均加標(biāo)回收率為85.0%～96.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～3.3%。結(jié)果說明,該檢測方法可以滿足日常質(zhì)量檢測分析的要求。個(gè)別數(shù)據(jù)回收率較低是由于使用的儀器檢出限較高,在測量的濃度范圍內(nèi)有效數(shù)字位數(shù)較少,導(dǎo)致計(jì)算出的回收率較低。

由于實(shí)驗(yàn)中所用單通道液相色譜檢測一個(gè)樣品所需時(shí)間為15 min,當(dāng)有多個(gè)樣品需要測定時(shí),長時(shí)間放置在室溫的蛋白質(zhì)樣品有可能發(fā)生降解或聚集,影響檢測結(jié)果。為了證實(shí)檢測結(jié)果的有效性,需要進(jìn)行檢測方法的穩(wěn)定性試驗(yàn),驗(yàn)證待測樣品在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。配制0.20 g/L的B2M溶液,在室溫放置5 h,每隔1 h在設(shè)定的色譜條件下測定其蛋白質(zhì)濃度,結(jié)果如圖4所示。在5 h內(nèi)蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果比較穩(wěn)定,沒有發(fā)生蛋白質(zhì)降解或聚集的情況,說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是穩(wěn)定可信的,測量過程中沒有二聚體生成。

表 1 B2M在磷酸鹽緩沖液(PBS)和二聚體溶液中的加標(biāo)

2.3.3凝膠過濾液相色譜法與免疫比濁試劑盒分析B2M樣品的優(yōu)勢比較

模擬了生產(chǎn)及儲(chǔ)存過程中B2M產(chǎn)品形成聚集體的情況來考察建立的B2M單體定量方法的準(zhǔn)確性。在B2M二聚體質(zhì)量濃度為0.40 g/L(其中B2M單體的本底質(zhì)量濃度為0.13 g/L)的PBS溶液中分別加入終質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3 g/L的B2M單體,分別使用凝膠過濾液相色譜法和B2M免疫比濁試劑盒檢測樣品中B2M單體的濃度。結(jié)果如表2所示,當(dāng)溶液中有B2M二聚體時(shí),免疫比濁試劑盒的檢測結(jié)果受到較大干擾,測得的溶液本底濃度達(dá)到了實(shí)際值的4倍左右,進(jìn)而導(dǎo)致計(jì)算加標(biāo)結(jié)果的回收率也產(chǎn)生較大偏差。而凝膠過濾色譜法能夠準(zhǔn)確地測量出B2M單體的本底濃度,回收率計(jì)算結(jié)果也保持良好的準(zhǔn)確度,回收率范圍是95%～110%。結(jié)果表明,免疫比濁試劑盒無法用于B2M標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控,而凝膠過濾色譜檢測方法在有二聚體存在的溶液中仍然可以準(zhǔn)確定量B2M單體。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中,根據(jù)測得的總蛋白質(zhì)質(zhì)量與凝聚過濾色譜測得的單體B2M質(zhì)量,可以計(jì)算出樣品中二聚體的含量,進(jìn)而判斷樣品是否滿足質(zhì)量要求。

圖 4 B2M樣品的穩(wěn)定性(n=3)Fig. 4 Stability of the B2M sample (n=3)

表 2 凝膠過濾色譜與免疫比濁試劑盒測定B2M二聚體溶液中單體

3 結(jié)論

建立了凝膠過濾色譜定性定量分析B2M單體的檢測方法。本方法主要適用于B2M單體標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)過程中產(chǎn)品的質(zhì)控檢驗(yàn),可以滿足B2M標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)過程中的純度及定量檢測需求,也可以用于B2M聚集體及聚集過程的相關(guān)基礎(chǔ)研究。