燕 蒙,趙 洋,張養(yǎng)軍,應(yīng)萬(wàn)濤*,錢(qián)小紅,*

(1. 廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所,蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-北京, 北京 102206)

色譜和質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展,推動(dòng)了復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)組成和動(dòng)態(tài)變化的深度覆蓋鑒定與定量研究[1-3]。復(fù)雜生物樣本常常擁有具有高達(dá)10個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍,導(dǎo)致液相色譜的分離性能和質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)范圍難以在單次分析中充分識(shí)別樣品成分。因此在質(zhì)譜分析前端,首先運(yùn)用多維液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)分離成為當(dāng)前應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組復(fù)雜性的重要解決方案。

多維液相色譜系統(tǒng)提供了高效的肽段分離方案,降低肽段的共洗脫,提高了峰容量,同時(shí)增加了針對(duì)復(fù)雜體系檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍,從而鑒定到更多數(shù)量的肽和蛋白質(zhì)。其中,在線(xiàn)或離線(xiàn)二維液相色譜分離,在蛋白質(zhì)組研究中被廣泛運(yùn)用。二維色譜由常見(jiàn)的色譜分離方式組合而成,根據(jù)不同分離機(jī)理分為離子交換色譜、親水相互作用色譜、反相色譜等方法[4]。其中反相液相色譜(RPLC)具有分析速度快,分離效率高,而且流動(dòng)相與質(zhì)譜電噴霧電離(ESI)等電離技術(shù)相容,通常作為第二維分離模式。2005年,Gilar等[5]提出高pH反相色譜分餾作為第一維離線(xiàn)色譜分離,與第二維低pH反相液相色譜相結(jié)合。盡管兩個(gè)維度的分離都是基于肽的疏水性質(zhì),但pH對(duì)某些殘基的電荷狀態(tài)和側(cè)鏈?zhǔn)杷缘挠绊懞艽?因此也可達(dá)到很好的分離正交性。與其他方法相比,二維反相色譜在兩個(gè)維度上都具有非常高的肽分離效率[6,7]。但是從應(yīng)用效果看,這兩個(gè)分離維度并不是完全正交的,分離組分間肽保留時(shí)間仍然存在一定相關(guān)性。為解決這一問(wèn)題,在一維柱后引入“級(jí)聯(lián)”收集方式[8],將不同時(shí)間洗脫的餾分組合,使第二維液相色譜整個(gè)洗脫周期得到更有效利用,從而提高質(zhì)譜鑒定的效率。

近年來(lái),二維液相色譜和質(zhì)譜相結(jié)合的定量方法越來(lái)越多地應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本或腫瘤組織等臨床樣本的深度定量蛋白質(zhì)組分析[9-11]。常規(guī)高效液相色譜(HPLC)采用線(xiàn)性連續(xù)梯度洗脫模式,具有較高分離效率,而且能靈活改變級(jí)聯(lián)收集方案。但目前常規(guī)HPLC仍存在的限制是對(duì)初始樣本的大量需求和復(fù)雜的合并過(guò)程,以及由此帶來(lái)的肽段的吸附損失。基于相同反相色譜分離原理的Stage-Tip[12-14]方法,有效降低了對(duì)初始樣本的大量需求,并且減少了復(fù)雜實(shí)驗(yàn)流程,是復(fù)雜肽段混合物預(yù)分離的有效工具。但是，StageTip方法只能采用階梯梯度洗脫,而且其預(yù)分離收集組分?jǐn)?shù)目很難改變。鑒于以上2種方法,本文嘗試建立基于超高效液相色譜(UPLC)-八端口轉(zhuǎn)子閥的微升級(jí)預(yù)分級(jí)系統(tǒng),使UPLC的高分辨率與八端口轉(zhuǎn)子閥自動(dòng)化的組分分餾相結(jié)合,在基于色譜柱的液相色譜分離系統(tǒng)中,實(shí)現(xiàn)微克級(jí)初始樣本的超高效自動(dòng)化預(yù)分離。通過(guò)與StageTip方法系統(tǒng)分析比較,UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)顯示良好的肽段二維分離正交性和鑒定重復(fù)性。本研究為微量復(fù)雜生物樣本提供了一種高分辨率、高重復(fù)性的蛋白質(zhì)組深度覆蓋策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-Exactive HF臺(tái)式四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀、pH計(jì)、高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;超高效液相色譜H-Class系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Waters公司;八端口轉(zhuǎn)子閥購(gòu)自美國(guó)VICI公司;ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm)購(gòu)自美國(guó)Waters公司;超聲波破碎儀購(gòu)自寧波新芝公司;真空濃縮蒸發(fā)儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Thermo公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;-80 ℃超低溫冰箱購(gòu)自日本Sanyo公司。

二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、氨水(NH3·H2O)、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、尿素(urea)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均為分析純,乙腈為色譜純,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司;蛋白酶抑制劑Cocktail購(gòu)于瑞士Roche公司;牛血清白蛋白(BSA)、測(cè)序級(jí)胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Promega公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、無(wú)菌磷酸緩沖液(PBS)均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、消化細(xì)胞用的0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。HepG2細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC),本實(shí)驗(yàn)室保存。30 kDa超濾管購(gòu)于美國(guó)Millipore公司;C8膜購(gòu)于美國(guó)3M公司;C18填料購(gòu)于中國(guó)天津博納艾杰爾公司;Tip槍頭購(gòu)自Axygen公司(美國(guó)); C18脫鹽柱購(gòu)于美國(guó)Waters公司。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1細(xì)胞全蛋白質(zhì)提取

使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2,在37 ℃含5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳及95%(體積分?jǐn)?shù))空氣飽和濕度溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。使用0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶-EDTA溶液消化收集細(xì)胞,離心去上清后,加入PBS溶液清洗。隨后加入0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl,重懸,加入等體積4%(質(zhì)量(g)/體積(100 mL))SDS溶液、10 μL蛋白酶抑制劑。冰浴超聲裂解,超聲功率為180 W,超聲1 s,停頓2 s,共99個(gè)循環(huán)。將蛋白質(zhì)樣本于4 ℃以20 000 r/min的速度離心10 min,取上清液,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。分裝后存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蛋白質(zhì)酶切

取500 μg HepG2細(xì)胞全蛋白質(zhì)或BSA,加入8 mol/L尿素,將溶劑體系補(bǔ)足至500 μL,全部轉(zhuǎn)移至30 kDa超濾管,以20 000 r/min的速度離心20 min,以替換溶劑體系。在超濾管中加入100 μL 20 mmol/L DTT,在37 ℃恒溫箱還原反應(yīng)4 h。取出超濾管,以20 000 r/min的速度離心15 min,加入100 μL 50 mmol/L IAA,在室溫暗處反應(yīng)30 min。以20 000 r/min的速度離心15 min,加入100 μL 20 mmol/L DTT,在室溫暗處反應(yīng)15 min。以20 000 r/min的速度離心15 min,加入200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨,以20 000 r/min的速度離心15 min,此步驟重復(fù)一次。更換新套管,按照胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶50的比例加入20 μL 0.5 g/L胰蛋白酶,振蕩混勻,于37 ℃恒溫箱孵育過(guò)夜(>12 h),以20 000 r/min的速度離心15 min,回收液體,依次加入200 μL碳酸氫銨和超純水,以20 000 r/min的速度離心15 min,回收液體并合并,放入真空濃縮蒸發(fā)儀熱干,于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分離

采用Waters超高效液相色譜H-Class系統(tǒng),以Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色譜柱作為第一維分析柱,配在線(xiàn)過(guò)濾器。在高pH條件下進(jìn)行液相色譜分離,流動(dòng)相A為2%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈-98%水,流動(dòng)相B為98%乙腈-2%水,流動(dòng)相A和流動(dòng)相B均含0.1%氨水溶液,pH為10。流速為150 μL/min,柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序:0～24 min, 5%B～30%B; 24～26 min, 30%B～95%B; 26～29 min, 95%B; 29～30 min, 95%B～5%B; 30～33 min, 5%B?？偺荻葧r(shí)長(zhǎng)為33 min。每次運(yùn)行結(jié)束后,回到初始狀態(tài),重新平衡7 min后再上樣。在低pH條件下進(jìn)行液相色譜分離,流動(dòng)相A為2%乙腈-98%水,流動(dòng)相B為98%乙腈-2%水,均含0.1%TFA溶液,pH為2。流速為150 μL/min,柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序:0～24 min, 5%B～30%B; 24～26 min, 30%B～95%B; 26～29 min, 95%B; 29～30 min, 95%B～5%B; 30～33 min, 5%B?？偺荻葧r(shí)長(zhǎng)為33 min。

色譜系統(tǒng)柱后連接八端口轉(zhuǎn)子閥,在3～28 min組分收集時(shí)間內(nèi),八端口轉(zhuǎn)子閥每隔60 s切換一次端口,將樣品肽段分為6組分和8組分。6組分收集方案中,第一個(gè)循環(huán)結(jié)束后,閥直接由第6個(gè)輸出端口轉(zhuǎn)換到第1個(gè)輸出端口,將新收集組分7合并到先前收集到的組分1中,以此類(lèi)推,將樣品合并成6個(gè)組分。8組分收集方案中,第一個(gè)循環(huán)結(jié)束后,閥直接由第8個(gè)輸出端口轉(zhuǎn)換到第1個(gè)輸出端口,將新收集組分9合并到先前收集到的組分1中,以此類(lèi)推,將樣品合并成8個(gè)組分。實(shí)驗(yàn)上樣量均為50 μg HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液酶切肽段,由流動(dòng)相A液溶解,進(jìn)樣體積為10 μL。收集的組分用真空濃縮蒸干儀于45 ℃熱干。

1.4 StageTip預(yù)分離

將5 mg C18填料溶于90 μL甲醇,轉(zhuǎn)移至底部填有C8膜的Tip槍頭,用注射器推壓,壓緊C18填料,即得StageTip裝置。將90 μL乙腈加入裝置中,用注射器推壓,重復(fù)一次,推壓過(guò)后加滿(mǎn)乙腈,填柱完成,靜置活化填料2 h后使用。配置pH 10的氨水溶液,溶解HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)酶切后的熱干肽段,渦旋振蕩,振蕩后測(cè)濃度。上樣前加入pH 10氨水平衡裝置柱,以1 500 r/min的速度離心7 min。上樣量為50 μg,用pH 10氨水稀釋至160 μL。將樣品分2次加入裝置中,以1 500 r/min的速度離心上樣,每次7 min。上樣完成后,將pH 10氨水加入裝置中脫鹽一次。配制6%(體積分?jǐn)?shù),下同)、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%、35%和50%乙腈-pH 10氨水10個(gè)洗脫梯度的洗脫液,每個(gè)梯度的洗脫液各取90 μL用于洗脫樣品。將6%、9%、12%、15%、18%和21%這6個(gè)梯度的洗脫液各用不同的Eppendorf管接收,再將25%梯度洗脫液合并到6%管中,30%洗脫液合并到9%管中,35%洗脫液合并到12%管,50%洗脫液合并到21%管。StageTip共分成6個(gè)組分。

1.5 第二維在線(xiàn)低pH HPLC-MS/MS

Q-Exactive HF臺(tái)式四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀分析樣本。使用自灌裝C18反相柱(120 mm×150 μm i. d.,填料粒徑1.9 μm),流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液。流速為600 nL/min,進(jìn)樣體積為5 μL。洗脫梯度:梯度洗脫程序:0～71 min, 5%B～32%B; 71～72 min, 32%B～95%B; 72～78 min, 95%B。在使用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行分析時(shí),一級(jí)質(zhì)譜分辨率為120 000,掃描范圍為m/z300～1 400,選擇一級(jí)譜圖中豐度最強(qiáng)的20個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)分析,高能碰撞解離(HCD)高能碰撞能量為27%。二級(jí)質(zhì)譜分辨率為15 000,掃描范圍為m/z200～2 000,最大注射時(shí)間為45 ms,自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)為5×104。

1.6 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用Maxquant(版本1.5.3.8)軟件搜庫(kù)。以Swissprot收錄人蛋白質(zhì)庫(kù)(20180518, 20 341條序列)為檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。搜庫(kù)時(shí)設(shè)置最大漏切位點(diǎn)為2;固定修飾設(shè)置為Carboxyamidomethylation(C);可變修飾設(shè)置為Acetyl(ProteinN-term)、Oxidation(M);其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 八端口轉(zhuǎn)子閥

八端口轉(zhuǎn)子閥是具有1個(gè)輸入端口和8個(gè)固定輸出端口的流量選擇流出閥,轉(zhuǎn)子在程序設(shè)定的時(shí)間間隔,切換至不同輸出端口,每個(gè)輸出端口通過(guò)管線(xiàn)連接到不同收集管中進(jìn)行樣品收集,一個(gè)循環(huán)結(jié)束后,閥轉(zhuǎn)換回第1個(gè)輸出端口,將新收集組分合并到先前收集到的組分中。以這種方式,裝置自動(dòng)收集和級(jí)聯(lián)組分,不需要額外樣品收集管及收集組分的再混合。八端口轉(zhuǎn)子閥的原理如圖1a所示?？刂栖浖com通過(guò)編程設(shè)定,不僅可以收集到8個(gè)輸出通道(A～H)的倍數(shù),而且還可以按實(shí)驗(yàn)方案收集到兩個(gè)或多個(gè)組分。八端口轉(zhuǎn)子閥全自動(dòng)化操作,有效地避免了因人員操作和復(fù)雜試驗(yàn)流程造成的誤差,有利于實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和定量應(yīng)用。八端口轉(zhuǎn)子閥通道內(nèi)徑為0.4 mm,有效減少了柱后分離組分的再次混合,降低組分間重疊率,更有利于蛋白質(zhì)及肽段的鑒定。

2.2 高效肽混合物預(yù)分級(jí)系統(tǒng)的建立

預(yù)分級(jí)系統(tǒng)主要由UPLC與八端口轉(zhuǎn)子閥組成,整個(gè)系統(tǒng)由轉(zhuǎn)子閥編程系統(tǒng)Vcom和液相操作軟件Empower 3控制,實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1b。其中UPLC包括液相四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣室、柱溫箱。

圖 1 八端口轉(zhuǎn)子閥分餾原理及分餾實(shí)驗(yàn)流程Fig. 1 Fractionation principle of the eight-port rotorvalve and its fractionation workflow a. Switch mechanism of the rotor valve, illustrating how the flow from the first dimension separation is divided into eight output lines (A-H); b. fractionation process based on the ultra-high performance liquid (UPLC) phase and the eight-port rotor valves.

以HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液酶切肽段為實(shí)驗(yàn)樣品,UPLC采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18柱作為第一維分離柱,在pH 10條件下,進(jìn)行33 min梯度洗脫。新開(kāi)啟色譜柱都需用BSA酶切肽段和HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液酶切肽段混合物進(jìn)行鈍化,每次試驗(yàn)前都使用BSA酶切肽段作為標(biāo)準(zhǔn)品,用于檢測(cè)色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性。

從超高壓第一維色譜柱上洗脫下的肽段,從柱后流入八端口轉(zhuǎn)子閥的輸入端口,在預(yù)定的時(shí)間間隔內(nèi),閥門(mén)切換到一個(gè)新的輸出端口,每個(gè)輸出端通過(guò)一個(gè)毛細(xì)管連接到收集裝置中的離心管中,將分離洗脫下的肽段進(jìn)行收集。因?yàn)閁PLC系統(tǒng)的流速為0.15 mL/min,每隔60 s切換一次端口,組分體積僅為150 μL,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高效分離的同時(shí),有效降低了樣本較大組分體積造成的吸附損失。

2.3 UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)系統(tǒng)第一維反相色譜分離表征

第一維高pH液相色譜條件下,經(jīng)過(guò)八端口轉(zhuǎn)子閥分餾與級(jí)聯(lián),按試驗(yàn)方案收集8個(gè)組分(見(jiàn)圖2a),通過(guò)紫外檢測(cè)器,在相同高pH液相色譜條件下對(duì)每個(gè)組分重新上樣,觀察組分間的分離度(見(jiàn)圖2b),可見(jiàn)相鄰組分之間重疊度很低,而相間組分的紫外峰基本無(wú)重疊。

圖 2 預(yù)分離的級(jí)聯(lián)方案和反相液相色譜二維分離正交性Fig. 2 Fractionation concatenation strategy and orthogonality of separation between the two dimensions of RPLC a. UV (214 nm) chromatogram for pH 10 separation and the eight-fraction concatenation scheme; b. eight chromatograms (RP with pH 10) of the concatenated fractions (panel A) using separation conditions that identical to those in panel A; c. eight chromatograms (RP with pH 2) of the concatenated fractions. Nos. 3-28: the fractions collected from the 3 min to the 28 min at intervals of 1 min from the first-dimensional RPLC. F1-F8: the first fractionation to the eighth fractionation.

將在第一維高pH液相色譜條件下收集到的8組分熱干后,采用相同的液相色譜儀器和C18柱,在低pH條件下進(jìn)行紫外檢測(cè)(見(jiàn)圖2c)。觀察到在33 min的低pH液相色譜洗脫梯度下,第一維高pH條件收集組分中的肽段都很好地分布于整個(gè)液相色譜的洗脫窗口,表明在不同pH值下的兩種反相液相色譜分離具有良好的正交性。

2.4 不同預(yù)分離方法鑒定結(jié)果比較

為了系統(tǒng)地比較微克級(jí)肽段混合物二維分離的效果,以HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液酶切肽段為實(shí)驗(yàn)樣品,將第一維高pH條件下液相色譜洗脫餾分按6組分方案進(jìn)行收集。同時(shí)采用常用的StageTip方法進(jìn)行預(yù)分級(jí)。StageTip也是基于高pH反相色譜條件的預(yù)分級(jí)方法,使用人工操作進(jìn)行階梯梯度洗脫分離及餾分匯合,分餾成6組分。兩種方法均使用50 μg相同的HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液酶切肽段進(jìn)行試驗(yàn),使用相同質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè),對(duì)其鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖3所示,與StageTip方法相比,采用UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥的收集策略,各個(gè)組分之間的質(zhì)譜峰呈現(xiàn)更為均勻的分布,提示更好的正交互補(bǔ)性。同時(shí),鑒定肽段和圖譜數(shù)的分布也顯示UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥方法可以將肽段更均勻地分布于各個(gè)組分,提供更好的分辨率。

圖 3 UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥方法和StageTip方法收集級(jí)聯(lián)組分在相同質(zhì)譜條件下的鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification results of the concatenated fractions by the UPLC-eight-port rotor valve strategy and theStageTip strategy under the same mass spectrometry conditions a. base peak chromatograms of the concatenated fractions using the UPLC-eight-port rotor valve strategy; b. base peak chromatograms of the concatenated fractions using the StageTip strategy; c: comparison of separation methods according to the distribution number of peptides; d: comparison of separation methods according to the distribution number of spectra identified via MS/MS. Tip: StageTip strategy. UPLC-8: UPLC-eight-port rotor valve strategy.

表 1 根據(jù)總蛋白質(zhì)數(shù)、獨(dú)特肽段、總肽段數(shù)、獨(dú)特肽段占總肽段數(shù)比例、平均序列覆蓋率對(duì)分離方法進(jìn)行比較

6F: six fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy. 8F: eight fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy.

綜合考慮試驗(yàn)時(shí)間和質(zhì)譜鑒定工作量,優(yōu)化UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)方法收集方案,在相同條件下,采用8組分收集方案[15],分離后組分在相同條件下進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表1。與StageTip方法相比,在收集6個(gè)組分情況下,新建UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥方法中鑒定總蛋白質(zhì)數(shù)、總肽段數(shù)、獨(dú)特肽段占比和平均序列覆蓋率都更高;與StageTip方法相比,新建UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥方法采用8組分接收方案,總蛋白質(zhì)鑒定數(shù)提高7.49%,總肽段鑒定數(shù)提高23.52%,獨(dú)特肽段鑒定數(shù)提高23.91%,平均序列覆蓋率提高11.89%。由此可知,UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分離方法通過(guò)靈活的改變接收方案,提高二維分離正交性,對(duì)肽段進(jìn)行高效的分離,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的深度覆蓋鑒定。

圖 4 UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥方法的高重復(fù)性和穩(wěn)定的分餾效率Fig. 4 High reproducibility and robust fractionation efficiency of the UPLC-eight-port rotor valve strategy a. the high overlap in the Venn diagrams of the quantified proteins from three replicates indicates good reproducibility of the eight fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy; b. the high overlap in the Venn diagrams of the quantified proteins from three replicates indicates good reproducibility of the six fraction pools from the UPLC-eight-port rotor valve strategy; c. the high overlap in the Venn diagrams of the quantified proteins from three replicates indicates the reproducibility of the StageTip strategy; d. comparison of the intensity based on the absolute quantification (iBAQ) intensity for the three replicates suggests the highly accurate quantitative reproducibility of the eight fraction pools valve strategy.

2.5 UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)方法的重現(xiàn)性

采用UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)方法和StageTip預(yù)分級(jí)方法對(duì)HepG2肽段混合物進(jìn)行鑒定,將3次重復(fù)試驗(yàn)鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目占試驗(yàn)鑒定總數(shù)目的比例作為重要依據(jù),考察預(yù)分級(jí)方法重復(fù)性。如圖4所示,在UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)方法中,采用8組分收集方案,3次試驗(yàn)同時(shí)鑒定到6 978個(gè)蛋白質(zhì),占鑒定到的蛋白質(zhì)的91.6%;采用6組分收集方案,3次試驗(yàn)同時(shí)鑒定到6 470個(gè)蛋白質(zhì),占鑒定到的蛋白質(zhì)的88.24%。在StageTip預(yù)分級(jí)方法中,3次試驗(yàn)同時(shí)鑒定到6 376個(gè)蛋白質(zhì),占鑒定到的蛋白質(zhì)的87.7%。此外,UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)方法的技術(shù)重復(fù)之間的定量重現(xiàn)性也非常高(決定系數(shù)R2>0.95,見(jiàn)圖4d)。由此可知,UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分級(jí)方法提供了很好的定量重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

在對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行深度和大規(guī)模表征的過(guò)程中,肽的預(yù)分級(jí)起著關(guān)鍵作用。本文基于UPLC和八端口轉(zhuǎn)子閥建立了新的RP-RPLC預(yù)分級(jí)方法,與StageTip系統(tǒng)比較表明,采用UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分離方法能顯著提高蛋白質(zhì)、肽段的鑒定數(shù)目和方法的重復(fù)性,并且能夠針對(duì)不同的情況,靈活地改變接收方案,對(duì)肽段樣本進(jìn)行精確鑒定。所建立的UPLC-八端口轉(zhuǎn)子閥預(yù)分離方法具有顯著的優(yōu)點(diǎn),有望在復(fù)雜生物樣本蛋白質(zhì)組研究中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高效分離和鑒定,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)組的深度覆蓋。