殷文賢，趙 萌，吳知桂，顧 立，陳美娟△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，四川瀘州 646000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)因其慢性并發(fā)癥而具有較高致殘、病死率。黃連治療消渴病古有記載，鹽酸小檗堿為黃連提純物，主要用于胃腸道感染。近年發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可用于T2DM治療，機(jī)制涉及降壓、降脂、減重、抗血小板聚集、胰島素增敏等[1-3]，但尚少見鹽酸小檗堿對T2DM模型動物血管平滑肌的作用報(bào)道。故本研究擬通過觀察不同濃度鹽酸小檗堿對T2DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、遷移及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的影響，探討其對T2DM大鼠VSMCs的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為小檗堿用于T2DM并發(fā)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 鹽酸小檗堿，中國食品藥品檢定研究院提供，黃色粉末，批號115-53-7；卡托普利(汕頭金石制藥廠)，批號091023；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，批號S0130。

1.2動物 30只體質(zhì)量(200±20)g的6～7周齡健康雄性SD大鼠，購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，Ⅰ級動物，合格證號：川實(shí)動字第017號。實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)(2016-021)。

1.3試劑 胰蛋白酶，美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Gibco公司；CCK-8，碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室，北京Vigorous公司；TGF-β1 ELISA試劑盒，上海藍(lán)基生物科技有限公司；胰島素放疫試劑盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。

1.4儀器 倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；一次性6、24、96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.5方法

1.5.1T2DM模型的構(gòu)建 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取20只造模，高糖高脂飼料(蔗糖20.0 g，豬油10.0 g，膽固醇2.5 g，膽酸鹽1.0 g，常規(guī)飼料66.5 g)喂養(yǎng)2個月，1個月時腹腔注射鏈脲佐菌素25 mg/kg；另10只為正常組，常規(guī)飲食喂養(yǎng)2個月，1個月時腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。兩組實(shí)驗(yàn)同時進(jìn)行。2個月后進(jìn)行評價，以空腹血糖大于7.0 mmol/L、餐后2 h血糖大于11.1 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)下降(P<0.05)的判定為造模成功，ISI=ln[1/(Ins×FPG)]。

1.5.2VSMCs培養(yǎng)及分組 分別將正常鼠和T2DM模型鼠脫頸處死后，迅速取出胸主動脈，除去結(jié)締組織并刮去內(nèi)膜后剪成1 mm×l mm×l mm左右的組織小塊，放入加了3 mL DMEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)的培養(yǎng)瓶，在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)并完成傳代。分別選取鑒定后的形態(tài)良好、生長旺盛的4～6代對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞備用。正常組為正常大鼠的VSMCs；T2DM模型大鼠的VSMCs分別用于模型組、陽性對照組、治療組1～5。

1.5.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將正常鼠和T2DM模型鼠的VSMCs懸液細(xì)胞濃度均調(diào)整至1×105/mL，接種于96孔板中，90 μL每孔，8個組每組5個復(fù)孔，正常加90 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)24 h后，空白組、模型組和正常組每孔各加10 μL無血清DMEM，陽性對照組加50 μg/mL的卡托普利10 μL，治療組1～5加100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的鹽酸小檗堿各10 μL[4]，放CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，培養(yǎng)1 h后在450 nm波長下酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度A值。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(A加藥-A空白孔)/(A不加藥-A空白孔)]×100%。

1.5.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 選用二十四孔培養(yǎng)板放入Transwell小室，上室加入細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×105/mL的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μL，下室治療1～5組依次加入濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg /mL的鹽酸小檗堿樣品各60 μL，陽性對照組加50 μg/mL的卡托普利60 μL,正常組加等體積無血清DMEM培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)孵育48 h，從小室取出后擦去上室濾膜內(nèi)表面及基質(zhì)膠殘存的細(xì)胞，然后用PBS液清洗遷移到濾膜外表面的細(xì)胞，固定、染色后，置鏡下隨機(jī)選5個高倍視野，記錄膜上細(xì)胞總數(shù)目。重復(fù)3次，取平均值。

1.5.5雙抗體夾心ELISA測定TGF-β1水平 將細(xì)胞濃度均調(diào)整為1×105/mL，分別接種于96孔板中，分組、加藥方法同1.5.3。CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)48 h后用無菌管收集細(xì)胞懸液，3 000 r/min離心20 min，取上清液。每孔所得上清液均分為3份，分別將各組上清液加入反應(yīng)孔中，洗滌后加入生物素化的抗大鼠TGF-β1抗體孵育60 min，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素，孵育30 min后加入顯色劑37 ℃避光顯色15～20 min，隨后加入終止液，混勻后5 min內(nèi)測量A值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出TGF-β1水平。上述各步驟加入的試劑均為100 μL/孔。

2 結(jié) 果

2.1T2DM大鼠模型的建立 模型大鼠經(jīng)高糖高脂喂養(yǎng)2個月+腹腔注射鏈脲佐菌素后，食量、飲水量、尿量增加明顯，活動減少，體質(zhì)量較正常組明顯降低(P<0.01)；與正常組比較，血糖(空腹、餐后2 h)、血胰島素明顯增加(P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量、血糖、胰島素敏感指數(shù)比較

*：P<0.05，#：P<0.01，與正常組比較

2.2VSMCs鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué) 正常大鼠VSMCs需6～8 d由組織塊中爬出，需20 d鋪滿培養(yǎng)瓶。顯微鏡下細(xì)胞呈細(xì)扇形、梭形、三角形或不規(guī)則形，胞質(zhì)密度高，胞漿豐富，不透明，有多個細(xì)胞突起，核卵圓居中，有多個核仁。細(xì)胞生長致密平行排列成束狀，重疊生長區(qū)域呈“峰-谷”狀。T2DM大鼠VSMCs需3～4 d就能從組織塊中爬出，只需8～12 d鋪滿培養(yǎng)瓶。細(xì)胞形態(tài)、胞漿、胞質(zhì)、胞核均與正常大鼠VSMCs相似，但細(xì)胞生長更為致密，重疊生長成束、成網(wǎng)、呈旋渦狀。見圖1。

A:正常大鼠VSMCs排列呈“峰-谷”狀;B:T2DM大鼠VSMCs排列呈旋渦狀

圖1 倒置相差顯微鏡下正常大鼠及糖尿病大鼠VSMCs(×100)

2.2.2生長曲線 VSMCs生長曲線近似“s”形，前3 d增殖旺盛，呈對數(shù)生長，3～5 d生長速度減慢，5～7 d后細(xì)胞逐漸死亡。T2DM大鼠胸主動脈VSMCs生長速度明顯快于正常組，呈異常增殖狀態(tài)。見圖2。

圖2 正常組和模型組大鼠VSMCs生長曲線

2.2.3SM α-actin鑒定 大鼠VSMCs的胞漿經(jīng)α-actin特異性染色呈棕黃色，胞核蘇木素染呈藍(lán)色，低倍鏡下見細(xì)胞大小不等、形態(tài)各異(長梭形、扇形、三角形及不規(guī)則形)；高倍鏡下胞漿內(nèi)見大量棕黃色、與細(xì)胞長軸平行的α-actin。模型組與正常組細(xì)胞比較胞漿棕黃色更深，同一視野下細(xì)胞數(shù)更多。見圖3。

A:正常組;B:T2DM

圖3 大鼠VSMCs的SM α-actin鑒定(×400)

2.3不同濃度鹽酸小檗堿對T2DM大鼠VSMCs增殖的影響 不同濃度鹽酸小檗堿對正常組大鼠和T2DM大鼠VSMCs的增殖均可產(chǎn)生抑制作用，抑制強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)。見圖4。

圖4 不同濃度鹽酸小檗堿對正常組和模型組VSMCs增殖的抑制率曲線

與正常組比較，模型組大鼠VSMCs增殖顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，各治療組及陽性對照組均VSMCs增殖明顯受抑制(P<0.01)；各治療組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，治療組1、2的抑制作用較強(qiáng)(P<0.01),治療組3則與之相當(dāng)(P>0.05)，治療組4相對較弱(P<0.05)。見表2。

2.4不同濃度鹽酸小檗堿對T2DM大鼠VSMCs遷移的影響 模型組穿膜細(xì)胞數(shù)較正常組明顯增加(P<0.01)；各治療組穿膜細(xì)胞數(shù)均少于模型組(P<0.01)，鹽酸小檗堿各組穿膜細(xì)胞數(shù)均減少，且與濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；治療組1穿膜細(xì)胞數(shù)明顯小于陽性對照組(P<0.01)，治療組3～5對糖尿病VSMCs遷移的抑制作用不及陽性對照組(P<0.05)。見表2。

表2 鹽酸小檗堿對T2DM大鼠VSMCs增殖、遷移、TGF-β1水平的影響

a：P<0.05，aa：P<0.01，與正常組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與陽性對照組比較；d：P<0.05，與治療組1比較；e：P<0.05，與治療組2比較；f：P<0.05，與治療組3比較

2.5不同濃度鹽酸小檗堿對T2DM大鼠VSMCs培養(yǎng)液中TGF-β1水平的影響 與正常組相比，模型組TGF-β1水平明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組及治療組1～4 TGF-β1水平均較低(P<0.05)，治療組5差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陽性對照組相比，治療組1、2 TGF-β1水平較低(P<0.05)，治療組3～5與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

T2DM的慢性并發(fā)癥(如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病、外周血管及冠脈動脈粥樣硬化)是其致殘致死的主要原因，其病變基礎(chǔ)多為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。VSMCs的過度增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)變作為AS進(jìn)程的關(guān)鍵因素，而成為T2DM慢性并發(fā)癥的發(fā)病基礎(chǔ)。TGF-β1是調(diào)控VSMCs增殖凋亡平衡的重要細(xì)胞因子，能誘使細(xì)胞外基質(zhì)沉積和成分改變，促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移。研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)TGF-β1能從基因水平抑制P-53和c-jun的表達(dá)，從而延緩T2DM大血管病變[5-6]。

《血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑在冠心病患者中應(yīng)用中國專家共識》[7]建議，卡托普利適用于所有確診的冠心病或其他AS患者。也有研究發(fā)現(xiàn)卡托普利能調(diào)節(jié)VSMCs增殖、凋亡因子表達(dá)[8]，故本實(shí)驗(yàn)選用卡托普利作為陽性對照。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿可減少T2DM大鼠VSMCs增殖與遷移，作用強(qiáng)度與其濃度呈正相關(guān)，與LEE等[9]發(fā)現(xiàn)小檗堿能抑制大鼠VSMCs增殖的結(jié)果一致，且100 μg/mL鹽酸小檗堿的作用明顯強(qiáng)于卡托普利(P<0.01)。結(jié)果提示鹽酸小檗堿從抑制VSMCs的增殖遷移來防治T2DM并發(fā)癥可能是有效的；實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能顯著降低T2DM大鼠VSMCs中TGF-β1水平，鹽酸小檗堿100、50 μg/mL組效果優(yōu)于陽性對照組(P<0.01)，提示鹽酸小檗堿抑制T2DM大鼠VSMCs增殖遷移可能與下調(diào)TGF-β1水平有關(guān)。Smad依賴性信號通路是TGF-β1誘導(dǎo)纖維化的最經(jīng)典的信號通路[10]，其通過Smads蛋白將信號由細(xì)胞外傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞水平發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管形成、調(diào)控細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等作用。鹽酸小檗堿下調(diào)TGF-β1是否通過該通路或是通過其他通路[11](如P38MAPK通路、SGK1通路、Notch、Wnt等)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，鹽酸小檗堿對T2DM大鼠VSMCs有明顯抑制增殖、遷移的作用，該作用可能與降低TGF-β1水平有關(guān)。抑制作用隨鹽酸小檗堿濃度增加而增強(qiáng)，高濃度鹽酸小檗堿(>50 μg/mL)的作用強(qiáng)于卡托普利，該發(fā)現(xiàn)為鹽酸小檗堿用于T2DM并發(fā)癥治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。