張 祥，王壘壘，姚俊朝，趙永輝，李賀揚(yáng)，劉旭光，龍銀波，劉 晨，王 鵬

(河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 061000)

微RNA(microRNA，miRNA)是一種長(zhǎng)17～25個(gè)核苷酸的單鏈內(nèi)源性的非編碼RNA,其可通過(guò)與靶基因的3′UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割或者翻譯抑制；也可以通過(guò)類似siRNA的RNA干擾途徑，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行抑制性調(diào)控[1-2]。它們?cè)谠S多正常生物學(xué)行為如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-578在BRCA1/2相關(guān)乳腺癌中表達(dá)下調(diào)且可影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、黏著斑激酶及缺氧誘導(dǎo)因子等信號(hào)通路[4]。PREX2a作為一種腫瘤相關(guān)蛋白，通過(guò)抑制同源性磷酸酶-張力蛋白活性在包括腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮生物學(xué)活性[5]。膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見惡性腫瘤以無(wú)限增殖及向周圍正常腦組織浸潤(rùn)而著稱，而miR-578在其發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用仍未有報(bào)道，本研究旨在探討miR-578對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織分別取自滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科腦膠質(zhì)瘤及癲癇手術(shù)治療患者，其中正常腦組織8例，不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤組織56例，其中Ⅱ級(jí)18例、Ⅲ級(jí)15例、Ⅳ級(jí)23例。人膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，由滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所凍存。miR-578類似物序列(5′-AAT GCT ATT ATA AAC CCA TT-3′)及陰性對(duì)照序列(5′-ACT ACC GTT GTT ATA GGT G-3′)由廣州瑞博生物公司合成。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)英杰公司，用于實(shí)施qPCR的miR-578定量試劑盒購(gòu)自上海吉瑪公司，GAPDH單抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，小牛血清和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，脂質(zhì)體Lipofetmiane2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，膜聯(lián)蛋白v-fitc凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，PREX2a(miR-578的直接作用底物)抗體購(gòu)自美國(guó)Abzoom公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液置于37 ℃ 5% CO2相對(duì)濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時(shí)將2×105個(gè)U87、U251接種在6孔板內(nèi)，待50%～80%細(xì)胞融合后，經(jīng)Lipofectamine2000介導(dǎo)將miR-578類似物和陰性序列分別轉(zhuǎn)染到上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后6 h更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2qPCR 采用Trizol法提取腦膠質(zhì)瘤組織與正常對(duì)照腦組織標(biāo)本中總RNA，轉(zhuǎn)染后48 h的miR-578類似物和陰性序列組U87、U251細(xì)胞總RNA。分別用miR-578和U6引物于熒光定量PCR儀(美國(guó)，7500型ABI)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，以U6作內(nèi)參。選用20 μL擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min循環(huán)1次；95 ℃ 12 s，62 ℃ 60 s，循環(huán)40次，每2秒升高0.2 ℃，循環(huán)1次。按相對(duì)表達(dá)倍數(shù)=2-(△Ct目的RNA-△Ct內(nèi)參RNA)計(jì)算各組織及細(xì)胞中miR-578和內(nèi)參U6的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Western blot U87、U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取總蛋白。取150 g上樣量，100 g/L十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)。0.05 g/mL脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人PREX2a一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜，加入小鼠抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育1 h。結(jié)果采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。

1.2.4噻唑藍(lán)(MTT)法 每組細(xì)胞按2×103個(gè)細(xì)胞(每孔200 mL)接種到96孔板，分別于接種后24、48、72 h每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200 mL，振蕩15 min，紫外分光光度計(jì)570 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后48 h，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，取2×103個(gè)細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)2周后，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗2次，甲醇固定15 min，0.5%的結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆?？寺⌒纬陕?(克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù) 轉(zhuǎn)染后48 h用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，收集至1.5 mL EP管中，PBS(0.01 mol/L，pH7.2)洗滌細(xì)胞2次，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞，75%乙醇1 mL、4 ℃固定18 h以上。200 μL RNAase(1 mg/mL)、37 ℃孵育30 min，800 μL碘化丙啶(PI)染色液混勻后4 ℃避光染色30 min，應(yīng)用FACS Calibur(美國(guó)BD公司)流式細(xì)胞儀在488 nm檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中miR-578表達(dá)情況 qPCR結(jié)果顯示，WHOⅣ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中miR-578表達(dá)水平為(18.20±2.53)%，WHOⅢ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中miR-578表達(dá)水平為(36.20±3.34)%，WHOⅡ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中miR-578表達(dá)水平為(51.40±4.30)%；正常腦組織中miR-578表達(dá)水平為(59.60±4.31)%。miR-578表達(dá)與膠質(zhì)瘤級(jí)別呈負(fù)相關(guān)(r=0.912，P=0.00)；膠質(zhì)瘤組織中miR-578水平較正常腦組織明顯降低(P<0.01)，見圖1。

圖1 qPCR膠質(zhì)瘤和正常腦組織中miR-578表達(dá)情況

2.2膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-578、PREX2a表達(dá)情況 各細(xì)胞組的qPCR檢測(cè)到miR-578類似物組miR-578水平較轉(zhuǎn)入陰性序列組明顯升高(P<0.05)，見圖2；Western Blot檢測(cè)到各細(xì)胞組的miR-578類似物組miR-578的直接作用底物PREX2a表達(dá)較陰性序列組明顯下降(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-578相對(duì)表達(dá)情況

圖3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞PREX2a表達(dá)情況

圖4 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存能力情況

圖5 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存能力情況

A:U87細(xì)胞陰性序列組；B：U87細(xì)胞miR-578類似物組;C:U251細(xì)胞陰性序列組；D:U251細(xì)胞miR-578類似物組

圖6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率情況

圖7 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況

2.2轉(zhuǎn)入miR-578類似物后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響 與轉(zhuǎn)入陰性序列組比，U87細(xì)胞系的miR-578類似物組膠質(zhì)瘤細(xì)胞在24、48、72 h的增殖率分別為(81.65±4.03)%、(68.38±3.67)%、(53.67±3.28)%，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖率則分別為(79.67±3.06)%、(61.87±4.66)%、(45.39±2.84)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

2.3細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 與陰性序列組比較，轉(zhuǎn)入miR-578類似物組U87細(xì)胞克隆形成率為(37.67±2.89)%、U251細(xì)胞為(34.67±3.26)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)情況 與陰性序列組比較，U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的miR-578類似物組凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖7。

3 討 論

惡性膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，屬人類預(yù)后極差的腫瘤之一[6-7]。隨著多模態(tài)三維影像融合與神經(jīng)導(dǎo)航、神經(jīng)電生理監(jiān)測(cè)與喚醒手術(shù)、術(shù)中實(shí)時(shí)成像等技術(shù)在臨床中逐步應(yīng)用；替莫唑胺(temozolomide,TMZ)聯(lián)合常規(guī)分割適形外照射的同步放化療及TMZ序貫化療成為惡性腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案；惡性腦膠質(zhì)瘤局部治療的手段逐漸豐富，包括卡莫司汀緩釋膜片及對(duì)流增強(qiáng)的局部化療，推高了惡性腦膠質(zhì)瘤的局部化療藥物濃度，使得腦膠質(zhì)瘤治療方法逐步增多，但其中位生存期仍不足18個(gè)月[8-10]。因此如何控制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移成為其治療的重要研究方向。

miRNA作為與正常及病理情況下細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)特性密切相關(guān)的內(nèi)源性非編碼RNA成為近年研究的重點(diǎn)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，眾多miRNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及腫瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，如miR-451在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖-遷移表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用；miR29C、miR134等與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。研究表明，PREX2a作為一種鳥氨酸交換因子(GEF)，其通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成促進(jìn)多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移且在膠質(zhì)瘤表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用，提示可能參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。

本研究Western Blot結(jié)果顯示，miR-578在正常腦組織中較腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯升高,且與腦膠質(zhì)瘤級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-578水平明顯較正常腦組織降低，表明其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)降低。轉(zhuǎn)入miR-578類似物后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-578水平明顯升高，PREX2a明顯下降。miR-578過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性明顯下降，表明miR-578在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中起到負(fù)性調(diào)控作用。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入外源性miR-578類似物后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞更容易凋亡，表明miRNA-578表達(dá)低的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存能力更強(qiáng)。

內(nèi)含子中編碼的miRNA作為一種細(xì)胞內(nèi)生因子，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)節(jié)比轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效果更快并且是可逆的[14]。以上研究結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)的miR-578可促進(jìn)細(xì)胞增殖及增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存能力，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PREX2a相關(guān)。提示miR-578可作為對(duì)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)，同時(shí)也為人腦膠質(zhì)瘤治療提供了新的思路。