周儀華,袁 影,盛志勇,王 舒,王 萌,郭良云

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.超聲科,南昌 330006)

膿毒癥性心肌損傷是膿毒癥休克難以糾正，導(dǎo)致患者最終死亡的重要原因，血紅素氧合酶-1(HO-1)對(duì)膿毒癥心肌損傷具有保護(hù)作用[1]。經(jīng)脂多糖(LPS)刺激后，有活力的心肌細(xì)胞通過(guò)TLR4/p13kγ信號(hào)通路分泌高遷移率族蛋白B-1(HMGB-1)，HMGB-1在LPS誘導(dǎo)的心臟收縮功能障礙中發(fā)揮重要作用[2]。在肺部、腸道等器官功能炎癥損傷動(dòng)物模型中，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié) HO-1及HMGB-1的釋放而發(fā)揮器官功能的保護(hù)作用[3-4]。HO-1的心肌保護(hù)作用是否與HMGB-1的表達(dá)存在特定關(guān)系仍然不清楚。本研究通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)方法建立膿毒癥大鼠心肌損傷模型，給予HO-1增強(qiáng)劑和抑制劑，檢測(cè)膿毒癥大鼠血漿中心肌損傷標(biāo)志物和HMGB-1的表達(dá)，明確HO-1與HMGB-1是否存在特定關(guān)系，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠128只(南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部提供)，體質(zhì)量180～220 g。

1.2方法

1.2.1模型的建立 所有大鼠術(shù)前禁食12 h，采用異氟烷吸入麻醉法誘導(dǎo)和維持大鼠麻醉狀態(tài)，用手術(shù)直剪于腹白線中點(diǎn)下方約0.3 cm處逐層剪開(kāi)皮膚、肌層和腹膜，直視下探查腹腔，將盲腸末端取出并置于腹壁外，采用4號(hào)縫合線距盲腸末端1.6 cm 處結(jié)扎，結(jié)扎后用3號(hào)三棱針穿刺1孔，之后分別將盲腸回納腹腔，4號(hào)縫合針逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后3 h左右自由進(jìn)食、飲水。觀察大鼠活動(dòng)、進(jìn)食、豎毛、腹瀉、眼球凹陷、呼吸等情況。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠128只，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、膿毒癥組、鈷原卟啉(Copp)Ⅸ組、鋅原足啉(Znpp)Ⅸ組，每組32只。假手術(shù)組除不做CLP術(shù)外，其余操作均同膿毒癥組；CoppⅨ組和ZnppⅨ組分別提前24 h給于HO-1增強(qiáng)劑CoppⅨ(10 mg/kg,腹腔注射)和抑制劑ZnppⅨ(10 mg/kg,腹腔注射)，以同樣方法制作膿毒癥模型。

1.2.3主要試劑及觀察指標(biāo) HO-1增強(qiáng)劑CoppⅨ(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)，HO-1抑制劑ZnppⅨ(美國(guó)Sigma公司)，10%水合氯醛溶液(上海強(qiáng)順化工有限公司)，10%甲醛溶液(西隴化工股份有限公司)，HMGBl和HO-1抗體及相關(guān)二抗(美國(guó)Cell Signaling公司)。各組均于0、6、12、24 h處死大鼠8只，開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取全血5～6 mL,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組血漿中CK-MB、cTnⅠ、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、HMGB-1水平，按試劑盒(美國(guó)Amersham公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化 取心臟組織，以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備石蠟切片，超薄切片機(jī)切片，切片厚度5 μm，行常規(guī)HE染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木素液染色，1%鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，乙醇伊紅染色，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，選擇橫斷心肌的切片放大200倍，顯微鏡下觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)變化情況。

1.2.5Western Blot檢測(cè)HMGB-1和HO-1蛋白表達(dá) 提取心肌細(xì)胞總蛋白，取25 μg總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入HMGB-1兔抗人單克隆抗體(1∶1 000)孵育,洗脫后加入辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶,充分洗脫后添加顯影液孵育，并于暗室中曝光。同樣方法檢測(cè)心肌細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1術(shù)后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后均很快蘇醒，各組均出現(xiàn)心率、呼吸加快，精神反應(yīng)差，部分呈嗜睡狀態(tài)，飲食差，豎毛，腹瀉等狀態(tài)，少數(shù)出現(xiàn)出血或出血傾向。假手術(shù)組術(shù)后3 h左右恢復(fù)正?；顒?dòng)、進(jìn)食、進(jìn)水。膿毒癥組在24 h死亡1只，ZnppⅨ組24 h死亡2只。

表1 各時(shí)間點(diǎn)血清H-FABP、HMGB-1及HO-1水平

續(xù)表1 各時(shí)間點(diǎn)血清H-FABP、HMGB-1以及HO-1水平

a：P<0.05，與膿毒癥組同時(shí)間點(diǎn)比較；b：P<0.01，與CoppⅨ組同時(shí)間點(diǎn)相比較；c：P<0.05，與CoppⅨ組同時(shí)間點(diǎn)相比較；d：P<0.05，與膿毒癥組同時(shí)間點(diǎn)比較；e：P<0.01，與CoppⅨ組同時(shí)間點(diǎn)相比較

2.2各時(shí)間點(diǎn)血漿CK-MB、cTnⅠ、H-FABP及HMGB-1表達(dá)水平變化 膿毒癥組和ZnppⅨ組CK-MB、cTnⅠ升高，CoppⅨ組短暫升高后呈下降趨勢(shì)，與膿毒癥組和CoppⅨ組相比，ZnppⅨ組CK-MB、cTnⅠ升高明顯(P<0.05)。除假手術(shù)組外，其余各組H-FABP均在6 h內(nèi)升高，6 h后開(kāi)始下降，與CoppⅨ 組相比，ZnppⅨ組升高明顯(P<0.05)。假手術(shù)組HMGB-1表達(dá)水平無(wú)明顯變化，其余各組HMGB-1表達(dá)水平均升高，其中ZnppⅨ組升高最明顯，與膿毒癥組和CoppⅨ 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3HE染色法觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化 光鏡下觀察大鼠心臟的形態(tài)學(xué)變化：假手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)清晰，胞核完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，結(jié)構(gòu)正常；膿毒癥組可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫顯著，核溶解、壞死；CoppⅨ組細(xì)胞腫脹、心肌纖維排列尚整齊，胞核完整，未見(jiàn)核溶解、壞死；ZnppⅨ組可見(jiàn)明顯細(xì)胞腫脹，心肌纖維排列紊亂，核溶解壞死。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色光鏡下心肌組織結(jié)構(gòu)變化(×200)

2.4Western Blot檢測(cè)心肌細(xì)胞HMGB-1及HO-1蛋白的表達(dá) 假手術(shù)組HMGB-1和HO-1蛋白的表達(dá)較弱，其余3組HMGB-1和HO-1蛋白均有不同程度的表達(dá)，其中ZnppⅨ組HMGB-1蛋白的表達(dá)最顯著，與膿毒癥組和CoppⅨ組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CoppⅨ組HO-1蛋白的表達(dá)最顯著，與膿毒癥組和ZnppⅨ組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A:假手術(shù)組；B:膿毒癥組；C:CoppⅨ組；D:ZnppⅨ組

圖2 心肌細(xì)胞HMGB-1及HO-1蛋白的表達(dá)

3 討 論

膿毒癥時(shí)產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6等，這些炎癥因子可直接或間接損害心肌。這些細(xì)胞因子相互作用，可形成許多正反饋環(huán)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)持續(xù)加重，不僅可直接抑制心肌收縮功能，還參與心肌組織結(jié)構(gòu)的破壞，增加心臟前負(fù)荷，破壞心肌鈣穩(wěn)態(tài)。HMGB-1是相對(duì)于TNF-α、IL-1等新的“晚期”炎癥因子，是膿毒癥致死效應(yīng)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)，其表達(dá)水平與膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后高度相關(guān)[1]。H-FABP主要存在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中，血液和其他組織中水平極低，因此在診斷心肌損傷方面具有較高的特異性；有研究顯示，當(dāng)心肌受損時(shí)參與心肌脂肪酸的攝入、運(yùn)輸和代謝的H-FABP會(huì)在心肌損傷時(shí)穿過(guò)細(xì)胞膜漏入血液中[5]。由于其相對(duì)分子質(zhì)量小，在心肌受損情況下，可迅速穿過(guò)細(xì)胞膜漏入血管內(nèi)，這在診斷心肌損傷方面具有較高的敏感性[6]。本研究通過(guò)CLP方法建立膿毒癥大鼠模型，給予HO-1增強(qiáng)劑和抑制劑，檢測(cè)膿毒癥大鼠血漿中心肌損傷標(biāo)志物和HMGB-1的表達(dá)。表1可以看出，假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿中CK-MB、cTnⅠ、H-FABP無(wú)明顯變化，而其余3組各指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)6 h內(nèi)均有不同程度升高，從一定程度上證實(shí)膿毒癥大鼠心肌損傷動(dòng)物模型造模成功。

HO-1是一種細(xì)胞保護(hù)性蛋白，在炎性反應(yīng)過(guò)程中可以抵抗各種有害刺激導(dǎo)致的機(jī)體損傷。目前已證實(shí)，在膿毒癥心肌、肝臟、肺部等疾病的靶器官保護(hù)方面發(fā)揮重要作用[7-9]。從表1可以看出，ZnppⅨ組血漿中各心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnⅠ、H-FABP均較CoppⅨ組明顯升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因?yàn)镃oppⅨ是HO-1增強(qiáng)劑，而ZnppⅨ是HO-1抑制劑,因此，筆者推測(cè)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中CoppⅨ通過(guò)刺激HO-1的生成而發(fā)揮膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用，這與上述多數(shù)研究所述的HO-1具有器官保護(hù)功能基本一致。同樣，表1提示HMGB-1因子在ZnppⅨ組升高最明顯，而在CoppⅨ 組的表達(dá)雖有升高，但明顯低于CoppⅨ組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。筆者推測(cè)在膿毒癥心肌損傷動(dòng)物模型中，HO-1與HMGB-1之間可能有某種特定的關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠心臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯心肌損傷，ZnppⅨ組心臟組織細(xì)胞嚴(yán)重破壞，膿毒癥組次之，而CoppⅨ組心肌損傷明顯較ZnppⅨ組和膿毒癥組減輕，從心臟組織病理學(xué)角度證實(shí)在膿毒癥心肌損傷過(guò)程中HO-1發(fā)揮著心臟保護(hù)作用。

另外，通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)損傷心肌HMGB-1及HO-1的表達(dá)，從細(xì)胞的角度探討HMGB-1及HO-1在膿毒癥心肌損傷過(guò)程中發(fā)揮的作用以及它們之間可能存在的關(guān)系。圖2結(jié)果表明，假手術(shù)組HMGB-1和HO-1蛋白的表達(dá)均較弱，其余3組蛋白表達(dá)均有不同程度的增加。其中ZnppⅨ組HMGB-1蛋白的表達(dá)最顯著，而CoppⅨ組該蛋白表達(dá)最弱，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CoppⅨ組HO-1蛋白的表達(dá)最顯著，而ZnppⅨ組該蛋白表達(dá)最弱，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

LI等[3]的研究發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中氫氣可以通過(guò)上調(diào)HO-1的合成抑制HMGB-1的表達(dá)，改善肺組織的炎性反應(yīng)，并改善模型動(dòng)物的死亡率。YU等[4]建立膿毒癥大鼠腸功能損傷模型，給予氫氣進(jìn)行干預(yù)，研究發(fā)現(xiàn)，H2對(duì)野生型嚴(yán)重膿毒癥大鼠腸功能損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié) HO-1及HMGB-1的釋放，減少氧化應(yīng)激及炎癥損傷，增加存活率。KIM等[10]的研究也證實(shí)在巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中甘草皂苷可以通過(guò)上調(diào)H0-1的合成抑制LPS誘導(dǎo)的HMGB-1的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HO-1和HMGB-1可能存在特定關(guān)系，即HO-1升高HMGB-1即下降，而HO-1下降，HMGB-1即明顯升高。因此，筆者推測(cè)，HO-1可能通過(guò)抑制HMGB-1的表達(dá)而發(fā)揮膿毒癥心肌保護(hù)作用。