1.昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100

銀芩膠囊是在傣族“雅哇黃”方基礎上開發(fā)的現代制劑[1]，其主要由黃芩、金銀花、魚腥草、三七葉合理配伍而成，其內容物為黃色至黃褐色顆粒和粉末，氣微、味苦。本品具有清熱解毒之功效，用于治療外感風熱所致的發(fā)熱、咳嗽、咽痛及呼吸道感染、扁桃體感染和咽炎[2]。黃芩中黃酮及其苷類是其主要的藥效成分[3]，金銀花化學成分主要包括有機酸、黃酮類、三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油及微量元素等，其中有機酸以綠原酸類化合物為主[1,4]。三七葉中富含皂苷類成分[5]。魚腥草中揮發(fā)類成分較多，非揮發(fā)性成分較少，非揮發(fā)性成分主要有槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等[6]。中藥復方制劑通常由多味藥組成，其中所包含的化學成分上百種，這給復方制劑的研究帶來一定的困難。中藥指紋圖譜[7]是一種綜合的、可量化的分析手段，是目前符合中藥特點、評價中藥質量的控制模式之一。指紋圖譜能反映中藥制劑的整體特征，提高中藥復方制劑質量控制的專屬性，在鑒別和評價藥品內在質量方面的作用遠大于選擇一個指標成分測定含量的作用[8-9]。因此更為科學和合理，也更符合中藥的多途徑協調作用的藥理特點。

1 實驗材料

1.1 儀器與試藥 Waters RD.LC 高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q 超純水器，Millipone 公司；XP 205分析電子天平，梅特勒-托利多公司；X Bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。黃芩苷對照品(批號MUST-18010410,Purity 98.58%,HPLC)，中國科學院成都生物研究所；銀芩膠囊(批號：161009-01、161009-02、170605-01、170605-02、180401-01、180401-02、180206-01、180206-02、180307-01、180307-02)，昆藥集團股份有限公司；

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取芩膠囊內容物0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加70%甲醇10 mL，超聲處理20 min(功率250 W，頻率350 Hz)，進行提取兩次，再倒入10 mL離心管中離心15 min，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品，加70%甲醇制成每1 mL中含100 μg的溶液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：X Bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μ m)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，以表1中梯度洗脫條件洗脫；柱溫25 ℃；檢測波長：280 nm；流速1.0 mL/min。

表1 梯度洗脫表

2.4 方法學考察

2.4.1 儀器精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣6次，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.3%，各共有峰相對峰面積<0.13%合指紋圖譜技術標準的要求，結果顯示方法的精密度好。見表2。

2.4.2 重復性實驗 取同一批銀芩膠囊樣品，按“2.1”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，測得各共有峰的相對保留時間RSD<2.1%，各共有峰的相對峰面積RSD<0.12%。表明該方法重復性良好，符合指紋圖譜的測定要求。見表3。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，分別于0、6、12、24、36、48 h進行指紋圖譜測定，測定各共有峰的相對保留時間RSD<0.32%，各共有峰的相對峰面積RSD<0.89%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。見表4。

表2 銀芩膠囊共有峰精密度

注：4號峰(黃芩苷)為參照峰。

表3 銀芩膠囊共有峰重復性

注：4號峰(黃芩苷)為參照峰

表4 銀芩膠囊共有峰穩(wěn)定性

注：4號峰(黃芩苷)為參照峰。

2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的標記 分別制備10批昆藥集團生產的銀芩膠囊供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，色譜圖如圖1所示;各批銀芩膠囊指紋圖譜概貌一致，相似度值均大于0.98，總體相似度較高，見表5；選取8個共有峰作為特征指紋峰，建立銀芩膠囊對照指紋圖譜，如圖2所示。

分析十批銀芩膠囊HPLC色譜圖，峰4為黃芩苷，峰6為漢黃芩苷，峰7為黃芩素，峰8為漢黃芩素，其中峰4在色譜圖中分離效果較好，含量高，且為銀芩膠囊中藥的質量控制指標成分，故確定峰4黃芩苷為參照峰。

表5 十批銀芩膠囊指紋圖譜相似度評價

3 討論

3.1 固定相的選擇 本試驗比較了不同廠家不同型號的3種色譜柱：①Ulatimate AQ C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；②LUNA C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);③X Bridge C-18(4.6 mm×250 mm,5 μm);結果表明色譜柱①的分離效果較差，黃芩苷未能和小峰分離，且峰形不好。色譜柱③的黃芩苷峰也未能達到分離；色譜柱②的分離效果均良好，故選擇X Bridge C18色譜柱。

3.2 流動相體系的選擇 取同一供試品溶液，考察不同流動相體系對色譜峰分離效果的影響，采用甲醇-水流動相體系，因甲醇洗脫能力較弱，色譜峰峰形不好且出峰不完全。故考察了乙腈-水流動相體系，乙腈-0.1%甲酸水流動相體系、乙腈-0.1%乙酸水流動相體系。試驗過程中，采用梯度洗脫分離銀芩膠囊中的有效成分，結果表明，當流動相為乙腈-0.1%甲酸水時，色譜峰出峰完全且峰形較好。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液。

3.3 梯度的選擇 取同一供試品溶液，分別考察了三個梯度洗脫條件對色譜峰分離效果的影響，發(fā)現只有在表1梯度洗脫條件下，黃芩苷的峰能與其他小峰分開。因此選擇表1中的梯度條件進行洗脫。

3.4 檢測波長的選擇 取同一供試品溶液，以表1中梯度洗脫條件洗脫，進行檢測波長的選擇考察，取同一供試品溶液，測定某一特定成分含量的檢測波長通常不一定適合指紋圖譜的需要，為了獲得多層次的信息，需要選擇數個不同的檢測波長，同時銀芩膠囊為復方制劑，其所含化學成分較多。因此，在試驗中應使用PDA檢測器全波長檢測獲得3D指紋圖譜[10]。結果表明280 nm處可以得到較多的化學信息，故選擇280 nm作為檢測波長。

3.5 柱溫的選擇 取同一供試品溶液，考察不同色譜柱溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃)的色譜峰分離情況，測得三種不同溫度下色譜分離效果相似，因為25 ℃接近室溫，最終確定25 ℃為測定用柱溫。

4 結論

本試驗通過供試品前處理方法的研究，色譜條件的研究，最終確定銀芩膠囊指紋圖譜的分析方法，因目前銀芩膠囊僅在昆藥集團生產，因此產品批數較單一，后續(xù)還需大量樣品的質量跟蹤，數據積累，初步暫定銀芩膠囊的指紋圖譜相似度在0.90以上為合格。本研究嘗試了多種不同梯度的洗脫條件，最終確定了銀芩膠囊的指紋圖譜分析的色譜條件，考察確定了8個共有峰的對照指紋圖譜，方法快速、簡便、重復性好，經方法學驗證滿足其相關要求。本研究建立的一種銀芩膠囊的指紋圖譜分析方法適用性強，能夠全面反映產品的質量狀況。