1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000;2.陜西省交通醫(yī)院，陜西 西安 710000

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(特別是膠原物質(zhì))的過度沉積[1]，是各種病因引起的肝臟損傷后的一種損傷修復反應，其中肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)的活化是關鍵，因為肝臟受損后HSC活化是細胞外基質(zhì)的主要來源。氧化應激是造成HSC活化增殖的重要因素，研究表明氧化應激相關分子過氧化氫(H2O2)能夠刺激HSC活化增殖，改變細胞外基質(zhì)的沉降[2-3]。

隨著肝組織的持續(xù)損傷，增生的纖維組織逐步取代正常的肝組織，最終發(fā)展成為肝硬化，其在全球呈現(xiàn)出高發(fā)病率以及高死亡率[4]。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的一個中間環(huán)節(jié)。肝纖維化屬于可逆性病變[5]，若在臨床早期采取抗肝纖維化治療，將對慢性肝病的治療以及阻止肝硬化的發(fā)生會產(chǎn)生非常積極的作用。目前，在抗肝纖維化方面中醫(yī)藥表現(xiàn)出獨特的療效，而且多是采用舒肝理氣、活血類中藥，其對于多種慢性肝病的治療具有積極意義[6]。課題組前期研究表明，柴胡-黃芩配伍水煎液對大鼠肝纖維化模型具有良好的保護作用[7]，但對于柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎尚未見報道，故本實驗在建立體外H2O2刺激HSC活化增殖的基礎上，觀察柴胡-黃芩藥對不同分離部位的抗肝纖維化作用，以期尋找柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化主要藥效物質(zhì)基礎，為進一步研究抗肝纖維化藥物開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試藥 中藥材柴胡和黃芩均購自陜西中醫(yī)藥大學校醫(yī)院中藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學生藥教研室教師鑒定為正品，符合2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定標準。

1.2 細胞 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，購自灝洋生物公司。

1.3 試劑與材料 胎牛血清(批號：FB-10，美國KIRGEN公司)；DMEM-H(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(批號：1939066)、青鏈霉素雙抗(批號：1924794)美國Gibco公司；透明質(zhì)酸酶試劑盒(hy-aluronidase，HA，批號:201805)、層黏連蛋白試劑盒(laminin，LN，批號:201805)、Ⅲ型前膠原試劑盒(procollagen Ⅲ，PCⅢ，批號:201805)、Ⅳ型膠原試劑盒(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C，批號:201805)購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-四氮唑溴鹽)(批號：EZ2811B347，美國Sigma公司)；乙醇為分析純(天津市天力化學試劑有限公司)；D101大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司)；30%H2O2(天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司)。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO)；倒置顯微鏡(奧特 BDS200)；酶標儀(美國Bio Tek ELx808)；離心機(湘儀 L530)；雙人型超凈工作臺(新加坡 ESCO)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 方法

1.5.1 柴胡-黃芩水提液的制備 參照文獻及課題組前期實驗結(jié)果[8]，柴胡飲片50 g、黃芩飲片25 g，共75 g，加入8倍量水浸泡30 min，煎煮，并保持沸騰30 min；過濾，再加入8倍量水煎煮30 min。過濾，合并兩次濾液混勻濃縮至150 mL，即得濃度為0.5 g/mL的柴胡-黃芩水提液。將得到的柴胡-黃芩水提液平均分成兩份，一份用于分離制備不同部位，一份進行干燥得干粉用于后續(xù)體外實驗。

1.5.2 柴胡-黃芩不同分離部位的制備 參照文獻方法制備柴胡-黃芩不同分離部位[9-11]，將上述0.5 g/mL的柴胡-黃芩水提液上D101大孔吸附樹脂柱，徑高比為1∶10以上，依次用水和30%，60%，90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，得到水和30%，60%，90%乙醇洗脫4個不同極性部位，即水洗脫部位(A)、30%乙醇洗脫部位(B)、60%乙醇洗脫部位(C)、90%乙醇洗脫部位(D)，分別干燥得干燥粉末。

1.5.3 大鼠HSC的培養(yǎng) 將大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。取對數(shù)生長的HSC，以5×104(個)/mL濃度接種到96孔培養(yǎng)板中過夜。

1.5.4 H2O2刺激HSC增殖模型的建立 參照文獻方法建立H2O2刺激的HSC增殖模型[2-3]。將30%H2O2用無血清培養(yǎng)基進行稀釋，分別配制成為終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的H2O2溶液。加入到細胞貼壁后的96孔板中，每個濃度分別設6個復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶標儀單波長檢測OD值。按下列公式計算細胞存活率。

細胞存活率%=(試驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5.5 藥物處理 實驗分組如下:對照組(無藥物處理)，H2O2模型組(5 μmol/L H2O2作用24 h)，給藥組(5 μmol/L H2O2作用24 h后，再用柴胡-黃芩及A、B、C、D高中低劑量作用24 h)。

1.5.6 柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC增殖的影響 各組培養(yǎng)24 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，低速震蕩10 min，以充分溶解被還原的MTT結(jié)晶，酶標儀單波長檢測OD值。

1.5.7 柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 各組培養(yǎng)24 h后，收集細胞上清液，參照試劑盒使用說明書，應用ELISA法檢測HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量。

2 結(jié)果

2.1 H2O2刺激HSC增殖模型的建立 在H2O2濃度0～5 μmol/L范圍內(nèi)時，H2O2對HSC具有活化促增殖作用，且具有一定的劑量相關性；在H2O2濃度為5 μmol/L時對HSC具有明顯的活化促增殖作用(P<0.01)；在H2O2濃度大于5 μmol/L時，隨著濃度的不斷增大，H2O2對HSC的激活作用逐漸減弱，且在H2O2濃度為20μmol/L時HSC的存活率僅50%左右，H2O2對HSC表現(xiàn)為顯著的抑制作用(P<0.01)。綜上所述，本課題組選用5μmol/L H2O2作用24 h作為HSC的增殖模型。如圖1所示。

2.2 柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC增殖的影響 與對照組比較，H2O2干預后，能夠顯著促進 HSC的增殖(P<0.01)；與H2O2組相比，柴胡-黃芩組(高、中劑量組)、A組(高劑量組)、B組(高、中劑量組)、C組(高、中劑量組)及D組(高劑量組)對H2O2誘導的HSC增殖均具有一定的抑制作用，其中柴胡-黃芩高劑量組及B組高劑量組、C組高劑量組對H2O2誘導的HSC增殖具有尤其明顯的抑制作用(P<0.01)。見表1。

表1 柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC增殖的影響

注：與H2O2組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 與對照組比較，H2O2作用于HSC后，HSC分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯升高；與H2O2組比較，柴胡-黃芩組及A組、B組、C組、D組可以明顯降低H2O2誘導的HSC細胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其中柴胡-黃芩組高劑量組、A組高劑量組及B組高劑量組對其作用最為明顯(P<0.01)。見表2。

表2 柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響

注：與H2O2組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

HSC的激活過程是肝臟膠原產(chǎn)生和肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。在一系列刺激因素的作用下，HSC被活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，細胞大量增殖，合成細胞外基質(zhì)，在肝臟內(nèi)大量沉積，造成肝纖維化。氧化應激在HSC的活化和細胞外基質(zhì)生成中具有重要作用，H2O2是氧化應激的相關分子，多項研究發(fā)現(xiàn)H2O2能夠刺激HSC活化和細胞外基質(zhì)的生成[2-3]。

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)階段?，F(xiàn)研究認為肝纖維化是一個動態(tài)過程，屬于可逆性病變[5]，而肝硬化則是一種不可逆性病變。因此，抗肝纖維化則成為治療慢性肝病以及預防肝硬化的重要目標。源自漢代張仲景的小柴胡湯是臨床治療肝病的常用方劑，具有確切的抗肝纖維化療效[12-14]，柴胡-黃芩是小柴胡湯的核心藥對。本課題組前期以小柴胡湯中的核心藥對柴胡-黃芩的抗肝纖維化作用為切入點，研究發(fā)現(xiàn)其水提液具有確切抗肝纖維化作用[7]。為了進一步探究柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎，篩選出其發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位，故本實驗在建立體外H2O2刺激HSC活化增殖的基礎上，觀察柴胡-黃芩藥對不同分離部位的抗肝纖維化作用。

實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HSC經(jīng)H2O2刺激后，大量增殖，其細胞培養(yǎng)液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量顯著增加。由此可見，H2O2對于HSC具有一定的激活促增殖作用，使肝纖維化相關因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌顯著增加，顯現(xiàn)出肝纖維化傾向。給予柴胡-黃芩藥對及其不同分離部位的高、中、低劑量干預后，各給藥組中的HSC的增殖均受到抑制，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也有所降低，其中柴胡-黃芩及B、C高劑量組中的HSC受到的抑制作用最為明顯，具有一定的劑量相關性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

綜上所述，柴胡-黃芩藥對及其B、C部位對H2O2刺激的肝星狀細胞增殖具有一定的抑制作用，B、C可能是柴胡-黃芩抗肝纖維化的主要有效部位。據(jù)文獻報道柴胡中主要含多糖、皂苷、揮發(fā)油、黃酮、甾醇類等成分[15]，黃芩中主要含黃酮、萜類、苷類、揮發(fā)油等成分[16]。根據(jù)各成分的性質(zhì)推測B、C中可能含有的成分為皂苷、黃酮苷類等成分，但其具體成分有待進一步研究。單味中藥本身所含成分復雜多樣，藥對及復方甚之，且中醫(yī)復方講求整體性以及多種成分之間的相互關系，兩味中藥共同煎煮會出現(xiàn)怎樣的成分變化，以及不同分離部位進行重新配伍組合以后會出現(xiàn)怎樣的現(xiàn)象，有待進一步的研究，以期為抗肝纖維化中藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。