1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025

多糖是一類存在于動植物和微生物中的天然高分子化合物，具有重要的生物功能和寶貴的藥用價值[1]。研究認(rèn)為植物多糖普遍具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的活性，尤其對機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)比較顯著[2-4]。仙茅(CurculigoorchioidesGaertn)是石蒜科多年生草本植物，其藥用部位為根莖，其性溫，入腎，肝經(jīng)，主要功效有補(bǔ)腎助陽、益精血、強(qiáng)筋骨和行血消腫，主要用于腎陽不足、虛勞內(nèi)傷和筋骨疼痛等病癥[5]，仙茅多糖(Curculigoorchioidespolysaccharide，COP)是仙茅的水提醇沉部分，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)仙茅多糖能調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，也能通過增加小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7分泌活性因子TNF-α和NO，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化[6-7]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的非特異性免疫細(xì)胞，具有吞噬、清除病原體的，同時巨噬細(xì)胞也是許多多糖的主要作用靶細(xì)胞[8-9]。因此本實(shí)驗(yàn)擬將仙茅多糖分別作用于小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7和小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，探討仙茅多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響。

1 材料與儀器

1.1 動物 SPF級昆明種小鼠，雌性(雌性小鼠與雄性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的非特異性免疫功能沒有差異)，2月齡，體質(zhì)量為18～22 g，購自長沙天勤動物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SCXK(湘)2014-001，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具中。

1.2 細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫(編號：KCB200603YJ)。

1.3 試劑 仙茅藥材購買于貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為仙茅CurculigoorchioidesGaertn的根；熒光標(biāo)記大腸桿菌(V6694)購買于美國BD公司；DAPI溶液(C0065)、抗熒光衰減封片劑(S2100)購買自北京索萊寶科技有限公司。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(070912)購買于上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱(New Brunswick Galaxy 170s)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS U-RFL-T),生物安全柜(Haier HR60-HA2)。

2 方法

2.1 仙茅多糖的制備及濃度配置 參照文獻(xiàn)[10]制備仙茅多糖，仙茅根塊曬干粉碎后用75%～80%的乙醇脫脂處理后風(fēng)干打粉。稱取5 g干粉溶解于175 mL蒸餾水中，于95℃水浴加熱提取150 min。抽濾并收集濾液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取2次。濾液合并，減壓濃縮至一定體積后，加入終體積分?jǐn)?shù)不低于80%食用酒精沉淀。抽濾后沉淀物分別用90%酒精和丙酮洗滌，真空干燥后采用苯酚法測定其中多糖的含量為50%。仙茅多糖用無血清DMEM培養(yǎng)基中配制成濃度為500 μg/mL的母液，濾菌后4 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時用DMEM 培養(yǎng)基稀釋即得。

2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(含青霉素1×105U/L、鏈霉素1×105U/L，pH7.2～7.4)置于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第3代，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞提取 參照文獻(xiàn)[11-12]提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前3天給小鼠腹腔注射5%淀粉營養(yǎng)肉湯，每只小鼠注射1 mL、每天注射1次。干預(yù)結(jié)束后，小鼠脫頸處死并用75%酒精消毒，在無菌條件下，充分暴露小鼠腹部肌層，腹腔注入10 mL含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，輕揉腹部5 min，然后吸取小鼠腹腔細(xì)胞懸液，移入離心管中，離心3000 r/min,5 min,用預(yù)冷PBS洗2次；得到細(xì)胞接種于24孔板，每孔接種細(xì)胞106個，共18孔，培養(yǎng)4 h細(xì)胞貼壁，用預(yù)冷PBS洗2次，即得小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清，分別加入含不同濃度仙茅多糖的DMEM培養(yǎng)基，使仙茅多糖濃度為500，250，125，62.5，31.25，0 μg/mL，每組設(shè)3個平行孔，分別刺激36 h。

2.5 巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌 培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上清，預(yù)冷PBS洗2次，加入以雙蒸水200倍稀釋的熒光標(biāo)記大腸桿菌溶液(1mL/孔)，室溫避光孵育1.5 h。干預(yù)結(jié)束后，吸棄上清，臺盼藍(lán)染色5 min，PBS洗5次，每次3 min，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞。最后以DAPI染核5Smin，取出爬片蓋于載玻片上，滴加抗熒光衰減封片劑并封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.6 巨噬細(xì)胞吞噬百分率 玻片于熒光倒置顯微鏡下觀察200個細(xì)胞，記錄吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌的巨噬細(xì)胞數(shù)量；吞噬百分率(PP%)=200個巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌的巨噬細(xì)胞數(shù)量/200個細(xì)胞巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 仙茅多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響 如圖1所示，各組RAW264.7細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌后，細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形。正常對照組明顯可見RAW264.7細(xì)胞有吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌；與正常對照組比較，仙茅多糖組細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌明顯較多。表1所示，仙茅多糖組細(xì)胞吞噬百分率都比正常對照組細(xì)胞吞噬百分率顯著性增高(P<0.01)，仙茅多糖在濃度為31.25～500 μg /mL范圍內(nèi)能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力，且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。提示仙茅多糖能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能。

3.2 仙茅多糖對小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響 如圖2所示，小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌后，細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形。正常對照組明顯可見小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞有吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌；與正常對照組比較，仙茅多糖組細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌明顯較多。表2所示，仙茅多糖125～500 μg/mL組細(xì)胞吞噬百分率都比正常對照組吞噬百分率顯著性增高(P<0.05或P<0.01)，仙茅多糖在濃度為125～500 μg/mL范圍內(nèi)可以增強(qiáng)小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌的能力，且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。提示仙茅多糖能增強(qiáng)小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

表1 仙茅多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬百分率的影響

表2 仙茅多糖對小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率的影響

4 討論

巨噬細(xì)胞在正常機(jī)體的免疫防御過程中扮演著重要的角色，參與機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過程，是機(jī)體非特異性免疫防御的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于小鼠和人具有同源性，許多學(xué)者以小鼠來源的巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞模型研究人類巨噬細(xì)胞生理、病理免疫反應(yīng)。研究表明不同來源的巨噬細(xì)胞在復(fù)雜微環(huán)境中，其細(xì)胞形態(tài)、功能、表型會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的變化[10]。所以，體外研究不同來源的小鼠巨噬細(xì)胞對了解人體巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)(如吞噬、細(xì)胞因子分泌)具有重要意義。小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞是通過無菌性炎癥刺激獲取的，此細(xì)胞很好地保留了外周巨噬細(xì)胞的許多生理學(xué)特性，是比較接近生理狀態(tài)的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞源自Abelson鼠科的腹腔巨噬細(xì)胞，是一種白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞，其生理狀態(tài)、某些基因或細(xì)胞因子表達(dá)(其sIg-, Ia-、Thy1.2-表面抗原陰性)發(fā)生了改變，采用此細(xì)胞不可避免的會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用不同來源的小鼠巨噬細(xì)胞，以求更準(zhǔn)確的探討仙茅多糖對巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響。結(jié)果表明，仙茅多糖能增強(qiáng)這兩種不同來源的小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并且呈劑量依賴性增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能。