張文娟，薛 嫻，彭 飛，尤全剛，潘 晶，李成陽，賴熾敏

（1.中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 / 中國科學院沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學院大學，北京 100049；3.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350000）

沙漠化作為土地退化的一種主要表現(xiàn)形式，影響社會經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展以及人類的生存和進步[1]。青藏高原是全球獨特的地域單元，近年來區(qū)內(nèi)土地沙漠化不斷發(fā)展，已成為當?shù)刂饕纳鷳B(tài)環(huán)境問題之一[2]。2015年我國青藏高原沙漠化土地總面積已達到39.29萬km2，約占整個青藏高原區(qū)土地總面積的15.1%[3]。沙漠化土地廣泛分布在柴達木盆地、藏北高原、青南高原和大江大河河谷區(qū)[4]。

黃河源區(qū)位于青藏高原東部，是黃河重要的水源涵養(yǎng)區(qū)和補給區(qū)，歷史時期湖泊密布[5-6]。然而，青藏高原抬升和氣候變干，導致大湖泊開始解體、小湖泊逐漸干涸，在土層較薄的湖相沉積物上逐漸形成高寒草原[7]。近幾十年，受氣候變暖和不合理的人類活動影響，黃河源區(qū)的沙漠化土地總面積達 22 042.32 km2，占該區(qū)總土地面積的 16.77%，且沙漠化土地的面積和程度呈劇增態(tài)勢[8]；其主要分布在巴顏喀拉山北麓，散布于黃河干流兩側的湖泊周圍、河谷灘地、河岸階地及干涸湖灘[9]。黃河源區(qū)土地沙漠化影響畜牧業(yè)發(fā)展，危及黃河流域用水安全，是黃河源區(qū)最主要的生態(tài)環(huán)境問題[10-11]。

草方格沙障是沙漠化治理最有效的一種措施，被廣泛應用于我國北方沙漠化防治中[12]。黃河源區(qū)以高寒草地畜牧業(yè)為主，缺乏制作草方格的麥草和稻草等材料，且氣候較為濕潤，降雨較多，草方格沙障易腐爛，使用年限短[13]。因此，當?shù)厝嗣窭玫[石方格沙障代替草方格沙障作為固沙措施，并結合播草種的方法進行沙漠化治理[14-15]。但目前示范區(qū)內(nèi)沙化土地治理的成效還沒有相關研究和報道。因此，有必要對示范區(qū)內(nèi)礫石方格沙障/播草種的沙漠化土地恢復措施進行研究和評價，從而為今后高寒地區(qū)沙化土地的治理提供理論指導。

一般來講，退化土地恢復成效主要從土壤、植被和微生物3個方面進行評價[16]。但是研究區(qū)氣候寒冷、成壤作用弱、土壤發(fā)育程度較低，人工干預措施影響下土壤和植被的恢復過程相對緩慢[17]。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其多樣性和群落結構的變化可以反映土壤生態(tài)功能的變化[18-20]。因此，土壤微生物群落組成及結構變化可作為土壤環(huán)境及植被變化的指示因子。本研究采用MiSeq測序方法，以黃河源區(qū)沙化草地為研究對象，對不同人工干預措施和不同恢復年限樣地的土壤細菌和真菌群落組成進行高通量測序，旨在了解不同恢復措施對細菌和真菌群落結構及其動態(tài)變化的影響，揭示不同干預措施和恢復時間在沙化草地恢復中對土壤微生物種群演化的作用，以期為進一步開展黃河源區(qū)沙化防治工作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

圖1 研究區(qū)位置及采樣地點示意圖Figure 1 Location of the study area and sampling plots

研究區(qū)被稱為綿沙嶺，位于黃河源區(qū)214國道沿線(K504)的星星海湖岸沙地。研究區(qū)位置及采樣地點如圖1所示，地處 34°44'57.85" N，98°07'06.32" E，海拔 4 241 m。年平均氣溫 5.1 ℃，年平均降水量313.8 mm，其中86%的降水發(fā)生在5-9月[10]。研究區(qū)天然植被為高寒草原，其群落稀疏，結構簡單，主要以紫花針茅(Stipa purpurea)為建群種，伴生種有紫羊茅(Festuca rubra)、異針茅(S.aliena)、座花針茅(S.subsessiliflora)、釘柱委陵菜(Potentilla saundersiana)、細葉亞菊(Ajania tenuifolia)、沙生風毛菊(Saussurea arenaria)、乳白香青(Anaphalis lacteal)、矮火絨草(Leontopodium nanum)、鐮形棘豆(Oxytropis falcate)和鐵棒槌(Aconitum pendulum)等[21]。研究區(qū)草地退化后，植被主要由沙生風毛菊、鋪散亞菊(Ajania khartensis)、垂穂披堿草(Elymus nutans)、紫菀(Aster tataricus)等組成。研究區(qū)退化之前土壤為高寒草原土，多為水成、半水成土，土層較淺，在高寒氣候條件下，土壤成土過程十分緩慢[2, 17]。

自2005年開始，瑪多縣政府組織當?shù)孛癖婇_展工程和生物措施治理沙化土地。在星星海與214 國道之間的沙化土地上布設了規(guī)格為 2 m × 2 m的礫石方格沙障，面積約247 hm2。沙面穩(wěn)定后在沙障內(nèi)人工播撒了垂穂披堿草、早熟禾(Poa annua)等禾本科植物的草種。

1.2 試驗設計和樣品采集

本研究選擇了4種不同類型樣地，其中選擇鄰近干涸湖泊區(qū)域無人工措施干預的沙漠化區(qū)作為對照樣地，記為CK，4年播草種樣地記為P1(2013年)，4年礫石方格沙障 + 播草種樣地記為P2(2013年)，12年礫石方格沙障 + 播草種樣地記為P3(2005年)。選擇CK樣地作為其他3個有人工干預措施樣地的對照，以P1樣地和P2樣地對比分析不同干預措施對土壤環(huán)境的影響，P3樣地與P2樣地對比分析不同干預時間的礫石方格沙障 +播草種對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響。

2017年7月在研究區(qū)4個樣地進行樣品采集。在每個樣地內(nèi)分別隨機選取3個樣方，為3個重復。利用 30 cm × 30 cm 樣方框對樣地內(nèi)植被蓋度及植物群落組成進行調(diào)查，并用齊地面刈割法收獲地上生物量[22]。在樣方內(nèi)采用土柱法 (Φ = 60 mm)收集植物地下部分(0-10 cm)，用細水將泥土沖洗干凈后烘干根系并稱量其生物量[23]。同時，利用剖面法取地表0-10 cm土樣，將其分為兩部分：一部分用于測定土壤容重、含水量、有機碳、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮；另一部分經(jīng)混合(3個樣品合為一個)、均質、除雜(過1 mm篩)后收集在無菌離心管中，密封后使用干冰運至北京奧維森基因科技有限公司(http://www.allwegene.com/)進行測序(高通量測序樣品在野外采集完成后，放置于內(nèi)置冰盒的車載保溫箱內(nèi)，然后運抵實驗室)。

1.3 研究方法

1.3.1 土壤理化性質測定

土壤容重采用100 cm3環(huán)刀取樣測定；土壤含水量測定采用烘干法 (恒溫 105 ℃, 48 h)，稱干土重，計算土壤含水量；有機碳測定采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法；土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮測定采用美譜達UV-3300分光光度儀(中國，上海，美普達儀器有限公司)[24]。

1.3.2 土壤微生物多樣性檢測

稱取0.5 g新鮮土壤樣品進行微生物基因組總DNA的抽提，運用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，并鑒定DNA含量。PCR擴增采 用 TransGen AP221-02： TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。細菌16S rRNA基因通用引物為338F/806R[25]，真菌ITS rRNA基因區(qū)引物ITS1-F/ITS2[26]。參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求進行相應比例的混合?；?Illumina MiSeq PE300 測序平臺在北京奧維森基因科技有限公司上機測序。原始下機序列已提交到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(登錄號：PRJNA490458)。

1.4 統(tǒng)計學分析

運用QIIME(v1.8.0)軟件得到基于門和綱分類級別的細菌與真菌的相對豐度柱狀圖。Heatmap(熱圖)是基于Bray-Curtis法計算進化距離，運用臨接法(neighbor-joining method)分析后通過R語言vegan包完成。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用平均值和標準誤表示測定結果，組間比較采用單因素方差 (One-way ANOVA)分析，P＜ 0.05 有統(tǒng)計學意義 (SPSS for Windows, Version 17.0, Chicago, IL)。

2 結果

2.1 不同干預措施樣地的土壤和植被特征

表層土壤容重、含水量以及銨態(tài)氮含量在CK、P1、P2和 P3樣地之間均無顯著差異 (P＞ 0.05)(表 1)。土壤有機碳和硝態(tài)氮含量在CK、P1及P2樣地之間無顯著差異(P＞ 0.05)，而P3樣地表層土壤中有機碳和硝態(tài)氮含量顯著高于CK、P1和P2樣地的土壤有機碳和硝態(tài)氮含量(P＜ 0.05)。與CK、P1和P2樣地相比，P3樣地的土壤有機碳含量分別高出190.09%、60.98%和115.44%。與CK、P1和P2樣地相比，P3樣地的土壤硝態(tài)氮含量分別高出272.50%、60.12%和222.61%。

植被物種豐富度和總地上生物量在4個樣地之間無顯著差異(P＞ 0.05)，而雜類草地上生物量在P3樣地顯著高出 CK 樣地 342.27%(P＜ 0.05)(表 1)。植被蓋度在CK、P1和P2樣地之間無顯著差異(P＞0.05)，但P3樣地的植被蓋度顯著高于CK和P2樣地的植被蓋度(P＜ 0.05)。與CK和P2樣地相比，P3樣地的植被蓋度分別高出480.00%和148.39%。

2.2 基于MiSeq測序的不同干預措施樣地的物種組成

2.2.1 細菌群落組成

在門分類水平放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等21個共有門在CK、P1、P2和P3樣品中分別占比為99.19%、99.80%、99.87%和99.89%。排在第1位的菌群是放線菌門，該細菌種類在CK、P1、P2和P3樣地中相對豐度分別為30.33%、38.12%、23.20%和30.61%。變形菌門在CK、P1、P2和P3樣地中相對豐度分別為26.81%、22.24%、36.24%和28.61%。放線菌門在P1樣地中相對豐度最高，變形菌門在P2樣地相對豐度最高(圖 2a)。

在綱分類水平，α-變形菌綱(α-Proteobacteria)在4個樣地中占比最高且波動性較大，在CK、P1、P2和P3樣地的相對豐度分別為16.35%、16.73%、19.65%和26.97%(圖 2b)。β-變形菌綱 (β-Proteobacteria)、γ-變形菌綱 (γ-Proteobacteria)和 δ-變形菌綱 (δ-Proteobacteria)在各個樣地中占比均較低且波動較小，3種變形菌綱的相對豐度分別為3.67%、3.07%和1.80%(圖2b)。

表1 不同干預措施樣地土壤和植被特征 (n = 3)Table 1 Properties of the plant community and soil for each sample plot under different intervention measures (n = 3)

2.2.2 真菌群落組成

在門分類水平，子囊菌門(Ascomycota)在CK、P1、P2和P3樣地相對豐度最高，分別占比為79.17%、61.67%、66.78%和71.61%。擔子菌門(Basidiomycota)排在第2位，其在4個樣地中的相對豐度分別為4.87%、7.86%、10.42%和18.58%。子囊菌門在CK樣地中相對豐度最高，擔子菌門在P3樣地中相對豐度最高(圖3a)。

圖2 不同干預措施樣地土壤樣品在門水平(a)細菌群落相對豐度評估和綱水平變形菌(b)分布百分比Figure 2 Relative abundance of the bacterial community at the phylum (a) level and the class distribution of Proteobacteria (b) for each sample plot under different intervention measures

圖3 不同干預措施樣地土壤樣品在門水平(a)和綱水平(b)真菌群落相對豐度評估Figure 3 Relative abundance of the fungal community at the phylum (a) and class (b) levels for each sample plot under different intervention measures

在綱分類水平，糞殼菌綱(Sordariomycetes)在4類樣地中的相對豐度最高且變化較小，平均值為22.75%。未識別的菌綱在CK、P1和P23類樣地中相對豐度較高，為14.50%～34.20%；在P3樣地中相對豐度最低，為5.01%。P3樣地的座囊菌綱(Dothideomycetes)和銀耳菌綱(Tremellomycetes)相對豐度最高，分別為40.75%和15.03%。相反，錘舌菌綱(Leotiomycetes)的相對豐度在對照樣地CK中最高，為25.40%；在P3樣地中相對豐度最低，為3.42%(圖 3b)。

2.3 不同干預措施樣地微生物群落的β-多樣性

在基于豐度比較高的前20個屬水平的細菌類群的熱圖(圖4a)中，CK和P1樣地的細菌群落聚類為一組，P2和P3樣地的細菌群落聚成另一組，這表明CK和P1樣地的細菌群落相似系數(shù)較高，P2和P3樣地的細菌群落相似系數(shù)較高。在基于豐度比較高的前20個科水平的真菌類群的熱圖(圖4b)中，CK和P1樣地的真菌群落首先聚類在一起，然后再與P2樣地的真菌聚在一起，P3樣地的真菌群落單獨為一組，這表明CK、P1和P2樣地的真菌群落相似系數(shù)較高而P3樣地的真菌群落與CK、P1和P2樣地的真菌群落差異性比較大。

3 討論

土壤細菌和真菌是土壤有機物質礦化和腐殖質化過程的重要參與者[27]，其群落多樣性變化受土壤肥力[28-29]及植被特性[30-31]的影響。同時，土壤微生物又能夠調(diào)節(jié)植物生長，其在土壤中的數(shù)量及分布反映了植被的生長發(fā)育狀況和土壤肥力變化趨勢[32]。相關研究發(fā)現(xiàn)，細菌群落的放線菌門在極端環(huán)境中非常豐富，而變形菌門則更多地生長在土壤肥力較高和植物相對較為豐富的環(huán)境[33-34]。本研究中細菌群落中的放線菌門在CK和P1樣地的相對豐度高于P2樣地；然而變形菌門，尤其是α-變形菌綱在CK和P1樣地的相對豐度低于P2樣地(圖2)。以上研究結果證實，4年修復期的礫石方格沙障 + 播草種相結合的人工干預措施對黃河源區(qū)沙化土地的改良作用優(yōu)于單純的播草種干預措施。盡管播草種干預措施在黃河源區(qū)黑土灘退化草地的修復中取得了很好的效果[35-36]，但研究區(qū)風沙活動強烈、土壤發(fā)育微弱、土地貧瘠，只有與固沙措施相結合人工播草種才能更好地定殖與生長。細菌菌群聚類分析結果表明，與CK樣地相比，P1樣地的細菌群落沒有發(fā)生明顯變化，且兩類樣地的細菌菌群相似性較高聚為一組，進一步說明僅僅使用人工補播這一種干預措施，在高寒地區(qū)沙化土地改良中的成效不甚明顯；而P2和P3樣地的細菌群落發(fā)生了顯著變化，且這兩種類型樣地的細菌菌群由于相似系數(shù)較高聚為一組(圖4a)，說明本研究區(qū)礫石方格沙障 + 播草種相結合的人工干預措施有效改善了沙化土地的微生態(tài)環(huán)境。但是，區(qū)域土壤成土過程十分緩慢，致使植被和土壤的修復成效并不顯著，因此研究區(qū)植被物種豐富度和總地上生物量及土壤容重、含水量和銨態(tài)氮等因子在4個樣地間均無顯著變化(P＞ 0.05)(表1)。

圖4 基于豐度比較高的前20個屬水平的細菌類群(a)和科水平的真菌類群(b)的熱圖Figure 4 Bacterial (a) and fungal (b) distributions of the top 20 abundant genera and families, respectively

真菌群落的子囊菌門在土壤養(yǎng)分貧瘠的環(huán)境中較豐富，而擔子菌門則在土壤養(yǎng)分充足的環(huán)境中最為豐富[37-38]。有研究表明，座囊菌綱雖然屬于子囊菌門，但其能在極端環(huán)境中通過改善水分和營養(yǎng)物質的獲取而增強的植物生長[37]。本研究結果中，子囊菌門的座囊菌綱和擔子菌門的銀耳菌綱在P3樣地中豐富度最高。真菌菌群聚類分析結果表明，P3樣地的真菌群落與P2樣地的真菌群落差異系數(shù)較大(圖4b)，且植被蓋度及土壤有機碳、土壤硝態(tài)氮含量在P3樣地顯著高于CK和P2樣地(P＜0.05)(表 1)，說明礫石方格沙障 + 播草種相結合的干預措施其成效隨干預年限的延長而增強。

基于以上分析認為，高寒地區(qū)沙化草地的治理，應該采取工程措施和生物措施相結合的方法，綿沙嶺治沙科技先導示范區(qū)所采用的礫石方格沙障 +播草種相結合的干預措施優(yōu)于單一的播草種干預措施，促進了沙化草地表層養(yǎng)分積累，改變了土壤微生物結構，有利于植被的定殖和生長。但是，由于區(qū)域氣候寒冷、土壤成土過程緩慢，致使植被和土壤的修復過程長。而接種有益微生物菌劑能夠有效改善植物根基微生態(tài)環(huán)境，提高土壤水分和養(yǎng)分利用率，增強植物光合能力，促進植物生長[39-40]。因此，可在礫石方格沙障 + 播草種的干預方式基礎上，通過施肥、添加微生物菌劑等措施快速提高土壤肥力，使黃河源區(qū)沙化土地得到有效治理。

4 結論

4年修復期的礫石方格沙障 + 播草種相結合的人工干預措施對黃河源區(qū)沙化土地的改良作用優(yōu)于單純的播草種干預措施，且礫石方格沙障+播草種相結合的人工干預措施對沙化草地的改善成效隨干預年限的延長而增強。