馬書琴，魯旭陽

（1.河南師范大學(xué)旅游學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.中國科學(xué)院水利部成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所山地表生過程與生態(tài)調(diào)控重點實驗室，四川 成都 610041）

大氣二氧化碳(CO2)是全球變暖的主要溫室氣體之一，對溫室效應(yīng)的貢獻率高達60%[1-2]。土壤可通過生態(tài)系統(tǒng)呼吸過程向大氣釋放CO2，并受多種因素的影響，比如土壤動物和微生物活性，土壤水分、溫度、有機質(zhì)、銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)含量等[3-5]。其中有機質(zhì)作為土壤生態(tài)系統(tǒng)呼吸的主要碳源和能量來源，其含量的高低和化學(xué)組成特征直接關(guān)系著微生物代謝底物的多寡和質(zhì)量[6-7]。草地生態(tài)系統(tǒng)作為全球碳循環(huán)的重要組成部分，其土壤環(huán)境及養(yǎng)分含量與植被類型密切相關(guān)。因此，不同類型草地土壤中有機質(zhì)含量及組成可能通過影響土壤微生物數(shù)量和活性，進而影響土壤CO2的排放。

土壤有機質(zhì) (soil organic matter, SOM)是植物、微生物和動物殘體在微生物分解及其他物理化學(xué)過程中變換而成的復(fù)合物質(zhì)[8]，這種復(fù)雜性使得在分子尺度上研究SOM具有一定挑戰(zhàn)性。目前，熱裂解氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry, Py-GC/MS)技術(shù)被廣泛用于解析森林[9]、草原[10]和農(nóng)田[11]等生態(tài)系統(tǒng)的SOM特征，該方法可以從分子尺度上獲取SOM化學(xué)組成“指紋圖譜”[12]。依據(jù)Py-GC/MS獲取化合物的來源和相似性SOM主要分為多糖、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、酚類、脂肪酸類、烷烴類、芳香類、多環(huán)芳烴和萜烯類等物質(zhì)，這些物質(zhì)不同程度地影響著土壤微生物活性和土壤碳礦化過程[13]。如，Grandy等[14]研究加利福尼亞森林生態(tài)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)含氮化合物吡啶和吡咯的相對豐度與真菌和細菌比值呈負相關(guān)關(guān)系，而木質(zhì)素衍生物相對豐度與真菌和細菌比值呈正相關(guān)關(guān)系；White等[15]和Yang等[16]研究北極苔原生態(tài)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)SOM中易降解成分初級多糖和蛋白質(zhì)等，可以刺激微生物活性，從而促進自身轉(zhuǎn)化為CO2。綜上所述，SOM化學(xué)組成是影響土壤微生物活性和結(jié)構(gòu)及土壤CO2排放的重要因素。

藏北高寒草地是世界上典型的高寒生態(tài)系統(tǒng)和生態(tài)脆弱帶，其群落結(jié)構(gòu)簡單、自調(diào)節(jié)能力較弱，在全球碳循環(huán)調(diào)控中具有重要作用[17]。該區(qū)域由于低溫限制，部分有機質(zhì)成分被微生物降解利用，不易被微生物分解的成分則貯藏在土壤中，從而SOM在長期的不斷累積和轉(zhuǎn)化過程中形成了復(fù)雜的混合物[18]。關(guān)于藏北高寒草地生態(tài)系統(tǒng)的SOM化學(xué)組成和成分還尚未明確報道。另外，溫度、水分被認為是影響青藏高原草地CO2排放的重要因子，植物凋落物混合物質(zhì)和動物擾動也通過刺激微生物活性進而影響土壤CO2排放過程[19-20]。近年來研究認為，SOM的含量與土壤CO2排放量存在密切聯(lián)系，而且青藏高原地區(qū)溫度上升促進了SOM的分解，增加了土壤CO2的排放[21]。然而，SOM中哪些化學(xué)成分對土壤CO2排放起關(guān)鍵作用還鮮有研究。本研究利用Py-GC/MS方法研究SOM化學(xué)組成及其與土壤CO2排放和微生物數(shù)量的關(guān)系，分析藏北高寒草地土壤中是否存在某些特定的化學(xué)成分影響著SOM的生物穩(wěn)定性以及土壤CO2排放潛力。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域及試驗設(shè)計

本研究對象是藏北兩種不同類型草地(高寒草甸和高寒草原)，分別以矮嵩草(Kobresia humilis)和紫花針茅(Stipa purpurea)為主要物種，采樣點集中于西藏那曲市和阿里地區(qū)。該區(qū)域?qū)俑咴瓉喓畮夂騾^(qū)，寒冷干燥，無絕對無霜期。平均年降水量為298～462 mm，一年中大部分降水集中于6-8月。年均氣溫-2.8 ℃，最暖月為7月，月均溫度不及14 ℃，最冷月為1月，月均溫度為-10 ℃以下[22-23]。

在高寒草甸和高寒草原各布設(shè)5個樣點，共計10 樣點。在每個樣點選取 3 個 0.5 m × 0.5 m 樣方，用鐵鏟挖取土體表層0-15 cm土壤，混勻后并裝入塑封袋內(nèi)。土壤樣品分為兩份，一份過0.25 mm篩后風(fēng)干，用于測定土壤基本理化性質(zhì)和SOM化學(xué)組成；另一份混勻并過2 mm篩后，4 ℃冷藏，用于室內(nèi)培養(yǎng)測定CO2排放量和磷脂脂肪酸組成。野外采樣于2016年8月完成。

2016年9 月至2017年4月進行室內(nèi)培養(yǎng)試驗。將相當(dāng)于100 g干土的鮮土放置250 mL錐形瓶中，并用保鮮膜將瓶口封住后放置于恒溫培養(yǎng)箱中。由于樣品采自不同區(qū)域，本研究選擇微生物生長較適宜的溫濕度進行培養(yǎng)，設(shè)置每個處理中土壤水分為40%最大田間持水量(Water holding capacity, WHC)，在室內(nèi) 25 ℃ 培養(yǎng) 210 d，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。土壤CO2氣體的釋放在培養(yǎng)的前14 d，每2 d測定一次；第15天到第49天，每3 d測定一次；第50天到第210天，除特定情況外，約7 d測定一次。每次測定開始前用橡膠塞封住培養(yǎng)瓶口，用真空泵將培養(yǎng)瓶中抽為真空狀態(tài)，之后統(tǒng)一通入空氣(空氣為統(tǒng)一購置的干空氣)，并用注射器抽取空氣10 mL測定CO2濃度(w1)，然后在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2 h后再用注射器抽取培養(yǎng)瓶中土壤上部空間氣體10 mL測定CO2濃度(w2)，w2-w1值為恒溫培養(yǎng)2 h內(nèi)土壤CO2排放量。氣體樣品在取樣后24 h內(nèi)用安捷倫氣相色譜儀(Agilent 7890A,Agilent Technologies Inc., USA)測定。

1.2 樣品測定

土壤化學(xué)性質(zhì)采用常規(guī)分析法測定[24]。土壤NH4+-N以及NO3--N用流動注射分析儀測定；SOM含量和土壤全氮(TN)采用元素分析儀測定；pH采用酸度計測定；容重采用環(huán)刀法測定。用磷脂脂肪酸標(biāo)記土壤微生物，采用HP6890-HP5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液提取的磷脂脂肪酸的組成，獲得細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌磷脂脂肪酸標(biāo)志物的含量[25]。

采用Py-GC/MS方法測定SOM化學(xué)組成。將收集的用于測定有機化學(xué)成分的土壤樣品置陰涼處自由風(fēng)干，然后將其研磨成細粉。測定時，稱取磨細后的土壤樣品10～20 mg，利用Pyrofoil包裹，然后利用居里點熱裂解儀對樣品在590 ℃進行高溫裂解。將裂解后產(chǎn)品在線傳送到氣相色譜實驗室，界面溫度 250 ℃，分流比 50 ∶ 1，氦 (He)作為載氣，流速1.0 mL·min-1。裂解產(chǎn)品在氣相色譜柱中進行分離，分離時先在40 ℃保持5 min，然后以5 ℃·min-1速度加熱到 270 ℃，接著以 30 ℃·min-1速度跳躍，使最終溫度保持在300 ℃。將色譜柱分離的產(chǎn)品利用質(zhì)譜儀進行檢測，EI離子源電壓為70 eV，傳輸線溫度為 270 ℃，離子源溫度為200 ℃[26]。將Py-GC/MS分析獲取的峰利用自動質(zhì)譜 圖 解 卷 積 鑒 定 系 統(tǒng) (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, AMDIS 2.72)、質(zhì)譜庫 (National Institute of Standards and Technology,NIST MS Library 2014)和已發(fā)表的相關(guān)文獻進行分析和鑒定[27]。鑒定的化學(xué)成分利用相對豐度表示其含量大小，相對豐度不能反映出該化學(xué)成分在SOM中絕對的豐度，但是能反映出SOM各化學(xué)成分的相對組成特征，因此被廣泛用來分析SOM化學(xué)成分的相對定量。根據(jù)其性質(zhì)和前體物質(zhì)以及已發(fā)表的眾多文獻信息將SOM化學(xué)成分大體歸類為木質(zhì)素、脂質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)、含氮化合物等類別(化學(xué)組成)。根據(jù)測定的化學(xué)成分和確定的化學(xué)組成，構(gòu)建高寒草草甸和高寒草原SOM的“指紋圖譜”。

1.3 數(shù)據(jù)處理

土壤CO2的累積排放量(cumulative emissions)用以下公式計算[20]：

式中：F是指土壤 CO2的釋放速率 [mg·(kg·h)-1]，i是指第i個土壤樣品，ti+1-ti是指前后兩次土壤CO2釋放測定的時間差，n指總測定次數(shù)。

運用 SPSS 20.0(U.S., IBM, 2011)中獨立樣本 T檢驗對兩種草地類型土壤基本性質(zhì)及化學(xué)組成進行差異性比較；利用雙變量相關(guān)分析法分析SOM化學(xué)組成相對含量與微生物數(shù)量及CO2累積排放量之間的相關(guān)性。使用 Sigmaplot 10.0(Germany, Systat Software, Inc., 2006)進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 藏北高寒草地土壤基本性質(zhì)以及CO2排放特征

高寒草甸土壤SOM、NH4+-N和NO3--N含量顯著(P＜ 0.05)高于高寒草原土壤(表1)。高寒草原土壤容重 (1.44 g·cm-3)與高寒草甸土壤容重 (1.31 g·cm-3)間差異性未達到顯著水平 (P＞ 0.05)。

經(jīng)過210 d培養(yǎng)后，高寒草甸土壤CO2累積排放量 (1 246.67 mg·kg-1)顯著高于高寒草原土壤(643.15 mg·kg-1) (P＜0.05)。培養(yǎng)期間兩種土壤的 CO2排放通量均未出現(xiàn)明顯波動。高寒草甸土壤在培養(yǎng)過程中的平均 CO2排放通量為 0.23 mg· (kg·h)-1，高寒草原土壤為 0.11 mg·(kg·h)-1(圖 1)。

2.2 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)化學(xué)組成

對藏北高寒草甸和高寒草原SOM的Py-GC/MS圖譜和Nist 2014數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜圖進行比對，并去除無法識別的和僅有一個樣品中出現(xiàn)的化學(xué)成分，最終篩選出化學(xué)成分(表2)。所有土壤樣品可解析出的化學(xué)成分中，含氮化合物種類最多，為23種；其次是脂肪類，為12種；萜烯類和雜環(huán)類較少，分別為1和2種。在SOM化學(xué)組成中，D-丙氨酸(D-alanine)是主要含氮化合物，其次是吡啶(Pyridine)；芳香類化物的主要裂解產(chǎn)物是甲苯(占SOM化學(xué)組成的2.12%～5.38%)；酚(Phenol)(1.20%～4.41%)和2/3-甲基酚(2/3-Methylphenol)是主要的酚類化合物；糖醛(Furfural)是主要多糖類化合物，其中高寒草甸SOM中糖醛所占比例較高，其值大于3%；萘(Naphthalene)是主要的多雜環(huán)類(Polyaromatics)；木質(zhì)素化合物主要為2-甲氧基-4-乙烯基酚(2-Methoxy-4-vinylphenol) (表 2)。

表1 高寒草地生態(tài)系統(tǒng)土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemistry properties of different ecosystems

圖1 高寒草地土壤培養(yǎng)過程CO2排放通量和累積排放量Figure 1 Soil CO2 fluxes and cumulative emissions during the incubation period

表2 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)Py-GC/MS裂解產(chǎn)物Table 2 List of Py-GC/MS products in the alpine meadow and alpine steppe soil samples

Py-GC/MS圖譜解析結(jié)果顯示，高寒草甸和高寒草原SOM中含氮化合物相對豐度高于其他有機成分，占全部化合物的38.0%～52.5%。不過，兩種類型高寒草地土壤含氮化合物的相對含量無顯著差異(P＞ 0.05)；烷烯烴類、多糖類和芳香烴類則表現(xiàn)為高寒草甸土壤顯著(P＜ 0.05)高于高寒草原土壤；脂肪酸類、木質(zhì)素、多環(huán)芳烴類和酚類在兩種類型土壤間無顯著差異 (P＞ 0.05) (圖 2)。

圖2 藏北高寒草甸和高寒草原土壤有機質(zhì)化學(xué)組成相對含量Figure 2 Relative abundance of soil organic matter chemical composition in the alpine meadow and alpine steppe soils

2.3 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)化學(xué)組成與CO2排放的關(guān)系

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)(表3)，土壤CO2累積排放量與土壤中含氮化合物、烷烯烴類、脂肪類、木質(zhì)素類、酚類、多雜環(huán)芳香烴類不相關(guān)(P＞ 0.05)；而與芳香烴和多糖類相對含量顯著(P＜ 0.05)和極顯著正相關(guān)(P＜ 0.01)，其相關(guān)系數(shù)r分別為0.670和0.800?；?10 d室內(nèi)培養(yǎng)試驗，建立了關(guān)于多糖類與 CO2累積排放量之間關(guān)系式，為Y= 86.761X+344.87(R2= 0.632 1,P＜ 0.05)，式中Y為 CO2累積排放量(mg·kg-1)，X為SOM中多糖類物質(zhì)的相對含量(圖 3)。

表3 土壤有機質(zhì)化學(xué)組成與土壤CO2累積排放量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation analysis between the soil organic matter chemical composition and cumulative CO2 emission

圖3 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)化學(xué)組成多糖類相對含量與CO2累積排放量的相關(guān)關(guān)系Figure 3 Correlation analysis between the soil organic matter chemical composition and cumulative CO2 emission

2.4 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)化學(xué)組成與微生物之間關(guān)系

芳香烴類和多糖類的相對含量與土壤中磷脂脂肪酸生物標(biāo)記的細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌含量間顯著(P＜ 0.05)或極顯著正相關(guān)(P＜ 0.01)；含氮化合物的相對含量與微生物數(shù)量均顯著負相關(guān) (P＜ 0.05)(表 4)。

3 討論

3.1 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)化學(xué)組成對CO2釋放的影響

藏北高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中，SOM含量明顯影響土壤呼吸產(chǎn)生CO2，其中可溶性有機質(zhì)含量與土壤釋放的CO2存在密切聯(lián)系[5, 28]，表明SOM礦化過程中可溶性有機質(zhì)被優(yōu)先利用，如可溶性有機氮和可溶性有機碳[18]。Pare和Bedard-haughn[29]研究北極苔原生態(tài)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)烷類碳和芳香類也顯著影響土壤CO2的排放，這與本研究結(jié)果相一致，表明SOM作為藏北高寒草地生態(tài)系統(tǒng)土壤CO2是主要來源，除了在含量上影響著CO2的排放，其質(zhì)量上也與CO2排放存在一定聯(lián)系。

不同類型草地SOM化學(xué)組成結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度的差異直接決定了微生物的利用效率，從而導(dǎo)致土壤CO2排放過程存在差異性。通常認為，土壤微生物較易分解利用蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)，而對結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的芳香類化合物的降解能力較低[30-31]。本研究顯示，土壤CO2累積釋放量與多糖類顯著正相關(guān)，與含氮化合物顯著負相關(guān)，White等[15]和Dai等[32]也得到了類似結(jié)果。SOM中多糖的相對含量與CO2排放之間表現(xiàn)為較強相關(guān)性可能是由于SOM化學(xué)組成中多糖類物質(zhì)最易降解，其降解速率較快而降解程度較為徹底，為CO2排放提供了主要的碳源物質(zhì)，進而對預(yù)測土壤呼吸具有重要指導(dǎo)作用[15, 33]。

土壤中氮元素含量對CO2動態(tài)過程影響的研究大多數(shù)集中于無機態(tài)氮元素，而土壤中的無機氮素主要來源于微生物對有機氮的礦化作用。因此，土壤中有機氮的含量和質(zhì)量可能會影響土壤供氮能力進而間接影響土壤CO2的排放。已有研究表明土壤中含氮化合物(有機氮)中不同化學(xué)成分錯綜復(fù)雜的連接在一起可能抑制土壤中有機氮的降解過程，使得這部分物質(zhì)在土壤中相對穩(wěn)定[34]。本研究結(jié)果顯示，含氮化合物與CO2排放之間相關(guān)性未達到顯著水平，這可能是由于本研究培養(yǎng)時間較短，土壤微生物僅利用了土壤中已有的無機氮，而有機態(tài)氮未被分解利用，也可能是含氮化合物存在一定抗性，無法被微生物所降解利用，關(guān)于這部分研究可以考慮在未來采用同位素標(biāo)記方法深入分析。

3.2 藏北高寒草地土壤有機質(zhì)化學(xué)組成對微生物影響

土壤微生物作為草地土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，直接參與并調(diào)節(jié)著土壤物質(zhì)循環(huán)過程[35-36]。同時，土壤微生物對環(huán)境變化較為敏感，其數(shù)量、活性、分布特征以及分解有機物質(zhì)的能力與土壤中有機物質(zhì)含量和質(zhì)量密切相關(guān)[37]。微生物對SOM的分解是土壤CO2的主要來源，SOM化學(xué)組成除了與CO2排放量之間存在直接聯(lián)系，可能還影響著土壤中微生物數(shù)量。本研究顯示，土壤中細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌數(shù)量均與SOM中芳香烴和多糖類物質(zhì)相對含量密切相關(guān)，表明微生物在SOM化學(xué)組成中的重要作用。

表4 土壤有機質(zhì)化學(xué)組成與土壤微生物數(shù)量的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation analysis between the soil organic matter chemical composition and microbial quantity

SOM中多糖含量和質(zhì)量對土壤呼吸以及形成適宜植物生長的土壤結(jié)構(gòu)具有重要作用[38]，且該物質(zhì)是最易被微生物所分解和利用的成分[39]。因此，高寒草甸土壤相比高寒草原中的相對較為豐富的多糖類化學(xué)成分可能主要來源于微生物，這部分化合物被整合到微團聚體中，最終通過與有機礦物相互作用穩(wěn)定的保存下來[40]。藏北高寒草地土壤中細菌、真菌、革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌與芳香類化合物呈正相關(guān)關(guān)系，而與木質(zhì)素間相關(guān)性未達到顯著水平。木質(zhì)素是在真菌、細菌以及相關(guān)微生物共同作用下降解的，真菌占據(jù)著主要地位[39]。白腐真菌分泌的酚氧化酶可以將木質(zhì)素初步降解成為芳香烴化合物，特定的細菌進一步將這些成分礦化成低分子量的化合物[41]。細菌由于其來源廣泛且繁殖速度快，可以在木質(zhì)素的降解過程中起到輔助作用，如支鏈改性、環(huán)開裂和解聚等[42]。因此，藏北高寒草地土壤中木質(zhì)素可能是作為能源和碳源物質(zhì)被微生物分解，同時這些微生物可以產(chǎn)生相應(yīng)降解酶從而將木質(zhì)素轉(zhuǎn)化成芳香烴等低分子片段。藏北高寒草地SOM化學(xué)組成中含氮化合物負相關(guān)于所測定的微生物數(shù)量，說明多數(shù)有機氮對微生物生長和發(fā)育的貢獻要低于其他物質(zhì)，甚至可能抑制土壤中氮素在各形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)變[12]。

4 結(jié)論

本研究基于Py-GC/MS方法分析了藏北高寒草甸和高寒草原SOM本質(zhì)特征，并探討了不同化學(xué)組成對高寒草地土壤微生物數(shù)量和土壤CO2排放的影響。研究結(jié)果顯示高寒草甸和高寒草原兩種類型草地的SOM化學(xué)組成存在明顯差異，而且SOM化學(xué)組成中部分化合物的相對含量與土壤呼吸作用存在密切聯(lián)系。這從新視角和方法上認識了高寒環(huán)境下影響土壤CO2排放的決定性因素，也為研究不同環(huán)境條件土壤CO2排放特征提供新的理論依據(jù)。