呂冰潔, 趙 潔, 郝 東, 王曉芝, 王 濤, 李洪波, 楊 陽△

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，2老年醫(yī)學(xué)科，山東 濱州 256603)

近十幾年來非小細(xì)胞肺癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)增加的趨勢[1-2]，40%以上的非小細(xì)胞肺癌患者在接受治療后仍然會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[3]。目前針對非小細(xì)胞肺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、放療、化療及靶向治療，但晚期非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率仍然不到15%[4]。

細(xì)胞內(nèi)鞘磷脂代謝平衡在細(xì)胞的增殖與凋亡中發(fā)揮著重要的作用。體內(nèi)主要的鞘磷脂代謝物包括1-磷酸鞘氨醇、鞘氨醇以及神經(jīng)酰胺[5]，其中鞘氨醇和神經(jīng)酰胺可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長，而1-磷酸鞘氨醇則可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長。上述代謝產(chǎn)物之間相互平衡，保證了機(jī)體功能代謝的穩(wěn)定[6]。鞘氨醇激酶 1(sphingosine kinase 1，SPK1)是催化上述代謝產(chǎn)物之間相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，可以催化促凋亡因子鞘氨醇和神經(jīng)酰胺磷酸化形成抗凋亡因子1-磷酸鞘氨醇，因此SPK1的活化程度以及表達(dá)量的高低就決定了細(xì)胞凋亡的趨勢[7]。SPK1本身具有癌基因特性，當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)SPK1的過高表達(dá)時，一方面可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，一方面還有可能刺激細(xì)胞進(jìn)行惡性轉(zhuǎn)化[8]。目前已有研究提出SPK1的高表達(dá)與多種腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[9]。

雖然目前已有部分針對SPK1在細(xì)胞凋亡中作用的研究，但其相關(guān)下游信號通路的研究在國內(nèi)相對較少。小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)細(xì)胞可以在體外模擬非小細(xì)胞肺癌，本文通過將靶向SPK1基因的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至LLC細(xì)胞，構(gòu)建SPK1沉默模型，觀察其凋亡率，并對轉(zhuǎn)染后的LLC細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax含量進(jìn)行檢測，從而明確SPK1在Lewis肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

LLC細(xì)胞購自于南京凱基生物有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen；T4 DNA ligase及T4 DNA ligase buffer 購自NEB；EcoR I及AgeI購自NEB；Taqpolymerase購自TaKaRa；Protein Marker及dNTP購自Promega；硝酸纖維素膜購自Pell；胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco； 抗SPK1抗體購自Abcam；抗GAPDH抗體購自Santa Cruz；所有引物委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成；抗Bcl-2及Bax抗體購自Cell Signaling；Bax ELISA試劑盒及Bcl-2 ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海靜融生物科技有限公司。

熒光顯微鏡(Olympus)；全自動多功能酶標(biāo)儀(Thermo)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)；紫外凝膠攝像分析儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1SPK1基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)既往研究中證實(shí)有效的針對SPK1基因的特異性siRNA序列，選擇5’-GGGCAAGGCTCTGCAGCTC-3’作為干涉靶序列，合成模板序列。引物序列由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，正向引物序列為5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′；反向引物序列為5′-GTAATACGGTTATCCACGCG-3′。將模版序列與AgeI及EcoR I雙酶切后的線性質(zhì)粒載體連接，然后將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌中，利用PCR擴(kuò)增出全長序列，挑選陽性克隆送測序分析。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染至LLC細(xì)胞 將LLC細(xì)胞接種在6孔板上，當(dāng)細(xì)胞的密度約為70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照Lipfectamine 2000說明書實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，取1 μg重組質(zhì)粒與2 μL Lipofectamine 2000混合．然后用無血清培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。用稀釋后的Lipfectamine 2000-DNA混合液處理LLC細(xì)胞。在無血清培養(yǎng)基中，室溫下孵育20 min后開始轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。同時設(shè)置一個對照組，按上述步驟轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(siRNA-SPK1-Neg)進(jìn)入LLC細(xì)胞。

2.3熒光顯微鏡下觀察LLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 本實(shí)驗(yàn)采用的質(zhì)粒含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green flurescent protein，EGFP)，成功導(dǎo)入細(xì)胞后能夠呈陽性表達(dá)，在波長488 nm的藍(lán)光激發(fā)下可發(fā)出綠色熒光。在轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的情況，并拍照存檔。

2.4Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后LLC細(xì)胞中SPK1、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)水平 將收集的siRNA-SPK1組及siRNA-SPK1-Neg組細(xì)胞均用預(yù)冷的生理鹽水清洗，每孔加入裂解液150 μL，向其中加入1∶100的PMSF，置于冰上裂解 20 min。采用BSA法對蛋白總量進(jìn)行檢測，制備后的蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，用PVDF膜轉(zhuǎn)印蛋白。采用5%的脫脂奶粉將PVDF膜在室溫下封閉2 h，然后分別向siRNA-SPK1組及siRNA-SPK1-Neg組細(xì)胞中加入1∶1 000稀釋的I抗或1∶5 000用抗體稀釋液稀釋的GAPDH(內(nèi)參照)抗體，慢搖4 h后放置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。過夜后漂洗封閉液，向其中加入1∶3 000稀釋的 II 抗，室溫下置于搖床上孵育90 min，再次進(jìn)行漂洗，然后采用電化學(xué)發(fā)光液化學(xué)發(fā)光試劑盒對其進(jìn)行增強(qiáng)發(fā)光，最后用X線膠片進(jìn)行顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

2.5Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LLC細(xì)胞的凋亡率 選取處于對數(shù)生長期的LLC細(xì)胞，將其制備為細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行LLC細(xì)胞凋亡率的檢測。每份樣品收集1×104個細(xì)胞。

2.6ELISA法檢測Bax和Bcl-2的蛋白水平 采用ELISA法檢測2組細(xì)胞中Bax和Bcl-2的蛋白水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒載體測序鑒定

經(jīng)測序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，見圖1(此部分由上海吉凱基因化學(xué)有限公司完成)。

Figure 1.Plasmid vector sequencing results.

圖1 質(zhì)粒載體測序結(jié)果

2 熒光顯微鏡下觀察LLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)染后的LLC細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖2。

Figure 2.The transfection efficiency of LLC cells was observed under fluorescence microscope (×10).

圖2 熒光顯微鏡下觀察LLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

3 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后LLC細(xì)胞中SPK1蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，siRNA-SPK1組細(xì)胞SPK1的蛋白表達(dá)較siRNA-SPK1-Neg組低，表示siRNA-SPK1組細(xì)胞SPK1蛋白表達(dá)受抑制(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The protein expression level of SPK1 in the LLC cells after transfection was determined by Western blot. MeanSD.n=3.**P<0.01vssiRNA-SPK1-Neg group.

圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后LLC細(xì)胞中SPK1蛋白表達(dá)水平的變化

4 Annexin V-FITC/PI雙染及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LLC細(xì)胞凋亡率

培養(yǎng)48 h后，siRNA-SPK1-Neg組凋亡率為7.33%±1.09%，siRNA-SPK1組凋亡率為21.37%±1.28%，與siRNA-SPK1-Neg組相比，siRNA-SPK1組細(xì)胞凋亡率明顯高于siRNA-SPK1-Neg組(P<0.01)，見圖4。這說明在LLC細(xì)胞中，干擾SPK1的表達(dá)可促進(jìn)LLC細(xì)胞的凋亡。

5 Western blot 檢測LLC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，siRNA-SPK1組中Bax蛋白表達(dá)水平高于siRNA-SPK1-Neg組，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平低于siRNA-SPK1-Neg組，見圖5。

6 ELISA法檢測LLC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平比較

ELISA 結(jié)果顯示，siRNA-SPK1組中Bax的表達(dá)水平為14.28±2.09，siRNA-SPK1-Neg組Bax的表達(dá)水平為6.49±1.17，siRNA-SPK1組中Bax表達(dá)水平顯著高于siRNA-SPK1-Neg組(P<0.01)；siRNA-SPK1組中Bcl-2的表達(dá)水平為5.49±0.99，siRNA-SPK1-Neg組Bcl-2的表達(dá)水平為10.28±1.32，siRNA-SPK1組中Bcl-2表達(dá)水平顯著低于siRNA-SPK1-Neg組(P<0.01)，見圖6。

討 論

本研究中選取的LLC細(xì)胞可以在體外模擬非小細(xì)胞肺癌。在既往研究中，Song等[10]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的病例中SPK1水平顯著增加，人為的上調(diào)SPK1表達(dá)水平可以抑制由多西紫杉醇及阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抗凋亡蛋白Bcl-xL、TRAF1、C-IAP1以及C-IAP2的表達(dá)有關(guān)[10]。Johnson等[11]發(fā)現(xiàn)在25例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中SPK1的mRNA以及蛋白水平均明顯增加，說明了SPK1在非小細(xì)胞肺癌肺癌的發(fā)生過程中起到了一定的作用。Salinas等[12]在研究中提出，腹腔注射SPK1可以增強(qiáng)化療藥物多西他賽對非小細(xì)胞肺癌的敏感性。Pchejetski等[13]也提出在多種腫瘤的發(fā)展過程中,抑制SPK1活性可以增強(qiáng)化療的敏感性。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測siRNA-SPK1組與siRNA-SPK1-Neg組細(xì)胞的凋亡率得出，SPK1蛋白低表達(dá)的siRNA-SPK1組凋亡率高于SPK1蛋白正常表達(dá)的siRNA-SPK1-Neg組，說明在LLC細(xì)胞中，干擾SPK1的表達(dá)可促進(jìn)LLC細(xì)胞的凋亡，與上述既往的研究結(jié)果一致。雖然目前已有部分針對SPK1在細(xì)胞凋亡中的研究，但其相關(guān)下游信號通路的研究相對較少。

Figure 4.The apoptosis of LLC cells after transfection was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-SPK1-Neg group.

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后LLC細(xì)胞凋亡

Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of Bcl-2 and Bax in the LLC cells.

圖5 Western blot 檢測LLC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平

Figure 6.The protein expression levels of Bcl-2 and Bax in the LLC cells measured by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-SPK1-Neg group.

圖6 ELISA法檢測LLC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平

為了進(jìn)一步了解SPK1在LLC細(xì)胞凋亡發(fā)展過程中所處的地位和作用，我們利用Western blot技術(shù)及ELISA技術(shù)對完成SPK1轉(zhuǎn)染后的LLC細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax進(jìn)行了檢測。Bcl-2蛋白家族可以分為促凋亡因子以及抗凋亡因子，其中促凋亡因子主要有Bax、Bak、Bad、BclXS、Bid以及Bik等，而抗凋亡因子則主要有Bcl-2及Bcl-xL等，它們在細(xì)胞中的表達(dá)對調(diào)控細(xì)胞凋亡具有重要意義[14]。本研究中所選取的Bcl-2和Bax則是近年來Bcl-2家族研究中最具有代表性的抗凋亡因子及促凋亡因子。Bcl-2和Bax蛋白相互作用可形成異源二聚體，從而抑制凋亡；而若是Bax蛋白之間相互作用則可形成同源二聚體，從而促進(jìn)凋亡[15]。若細(xì)胞中出現(xiàn)Bax過表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)caspase激活數(shù)量增加[16]，并且可拮抗Bcl-2對細(xì)胞的保護(hù)作用從而引起細(xì)胞的凋亡[17]。本研究對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，LLC細(xì)胞在完成轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞中SPK1蛋白含量減少，并且在SPK1蛋白含量減少的siRNA-SPK1組中Bcl-2和Bax含量與siRNA-SPK1-Neg組相比發(fā)生顯著改變，其中抗凋亡蛋白Bcl-2含量減少，促凋亡蛋白Bax含量增加。結(jié)合本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測到的結(jié)果(siRNA-SPK1組較siRNA-SPK1-Neg組的凋亡率高)，可以得出結(jié)論，干擾SPK1的表達(dá)可以通過提高Bax表達(dá)水平和降低Bcl-2表達(dá)水平的途徑來發(fā)揮誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究在細(xì)胞水平初步證實(shí)了SPK1在LLC細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)胞凋亡率有關(guān)，SPK1在Lewis肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能有著重要的作用，并且可能通過Bcl-2/Bax途徑來影響LLC細(xì)胞凋亡。人為干擾SPK1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)可能通過對Bcl-2/Bax途徑的調(diào)節(jié)來發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。這一結(jié)果有可能達(dá)到提高目前治療非小細(xì)胞肺癌療效的目的，為治療提供新的思路及靶點(diǎn)。這將是本研究后續(xù)探索的方向。針對相關(guān)靶點(diǎn)開發(fā)新的治療方法有可能為非小細(xì)胞肺癌提供個體化治療策略以及新的治療思路。