項(xiàng)福英，江勝林，程賢鸚

(浙江醫(yī)院，浙江 杭州 310030)

卵巢癌是在世界范圍內(nèi)死亡率最高的婦科惡性腫瘤，目前卵巢癌患者的治療以手術(shù)和化療為主，且預(yù)后差，致死率較高[1]。因此，迫切需要研制一種治療卵巢癌的新方法和新藥物。千金藤素(cepharanthine)是一種從防己科千金藤屬植物千金藤中提取的異喹啉生物堿，具有廣泛的藥理作用。近年來(lái)，cepharanthine在腫瘤中的各種藥理學(xué)作用引起了研究人員關(guān)注。研究表明，cepharanthine可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的增殖[2-3]，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[4]，逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥[5-6]。然而，cepharanthine是否誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的自噬，分子機(jī)制又如何，目前研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究cepharanthine對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的作用及可能的分子機(jī)制，為cepharanthine用于卵巢癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞株 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2主要試劑 Cepharanthine購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度>98%；吖啶橙(acridine orange)、DMSO和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)購(gòu)自Sigma；胎牛血清購(gòu)自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技公司；抗LC3、AKT、p-AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔5.0×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%時(shí)，各組中加入不同濃度的cepharanthine處理24 h，其濃度分別為2、4、8、16和32 μmol/L，對(duì)照組中加入等體積的PBS，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，藥物作用結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入 1∶10稀釋過(guò)的CCK-8溶液100 μL，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(A)值，取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3吖啶橙染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期卵巢癌SKOV3細(xì)胞以2×104接種于24孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第 2天加入不同濃度的cepharanthine作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞24 h，棄去24孔板中的舊培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，用含終濃度為1 mg/L的吖啶橙溶液避光染色15 min，用PBS清洗染色后的細(xì)胞，清洗3遍，于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。吖啶橙能夠透過(guò)細(xì)胞并與胞質(zhì)內(nèi)酸性細(xì)胞器相結(jié)合，當(dāng)處于較低pH環(huán)境中可發(fā)出紅色熒光。卵巢癌SKOV3細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察，無(wú)自噬產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光，含有自噬溶酶體者呈紅色熒光。

2.4Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞以2×105接種于6孔板中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)照組給予正常培養(yǎng)液，給藥組分別給予8 μmol/L和 16 μmol/L cepharanthine作用24 h。收集細(xì)胞，提取總蛋白，然后用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度進(jìn)行定量。將定量后的蛋白樣品加入到配制好的丙烯酰胺凝膠泳道中電泳分離，然后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5% BSA的溶液將膜室溫封閉1 h后用TBST清洗3次，分別加入對(duì)應(yīng)I抗[LC3(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)]，4 ℃孵育過(guò)夜，次日用TBST洗膜后，加入對(duì)應(yīng)羊抗兔II抗(1∶3 000)，室溫?fù)u床孵育2 h后，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，定影后進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法檢測(cè)cepharanthine對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響。不同濃度(0、2、4、8、16和32 μmol/L)的cepharanthine作用于SKOV3細(xì)胞作用24 h，隨著藥物濃度的增加，cepharanthine對(duì)細(xì)胞活力的抑制逐漸增強(qiáng)(P<0.01)，見(jiàn)圖1，提示cepharanthine作用于SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞活力被顯著抑制。

2 千金藤素誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬溶酶體的生成

與對(duì)照組相比，不同濃度cepharanthine處理24 h后，隨著cepharanthine濃度增加，卵巢癌SKOV3細(xì)胞中染成亮紅色熒光比例增多，自噬程度逐漸增強(qiáng)，其中8 μmol/L和16 μmol/L cepharanthine組較為明顯，見(jiàn)圖2，提示細(xì)胞中自噬溶酶體的數(shù)量可能增多，自噬被激活。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇8 μmol/L和16 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。

Figure 1.The effect of cepharanthine on the cell viability in different groups after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1 不同濃度的千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響

3 千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響

用Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在8 μmol/L和16 μmol/L cepharanthine 作用下，自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖3。這說(shuō)明cepharanthine可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬。

4 千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，卵巢癌SKOV3細(xì)胞在8和16 μmol/L cepharanthine作用24 h后，p-AKT和p-mTOR蛋白水平顯著降低(P<0.01)，而AKT和mTOR的總蛋白水平無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖4。這一結(jié)果表明cepharanthine抑制了AKT和mTOR的磷酸化，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能參與了cepharanthine誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞自噬。

Figure 2.The change of autophagy vesicles in the ovarian cancer SKOV3 cells after treated with cepharanthine (acridine orange staining,×400).

圖2 不同濃度的千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的影響

5 千金藤素聯(lián)用 3-MA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測(cè)cepharanthine聯(lián)用自噬抑制劑3-MA(在加入cepharanthine前1 h加入3-MA 抑制自噬的發(fā)生)后SKOV3細(xì)胞活力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，在3-MA 與cepharanthine聯(lián)合給藥干預(yù)下，3-MA促進(jìn)了cepharanthine對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(P<0.01)，見(jiàn)圖5。這提示自噬抑制劑3-MA 聯(lián)合cepharanthine作用能增強(qiáng)cepharanthine對(duì)卵巢癌細(xì)胞活力的抑制作用。

討 論

卵巢癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，它的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)持續(xù)上升，化療是目前卵巢癌最有效的治療方法，但由于化療的毒副作用較大，預(yù)后差，因此尋找治療卵巢癌的新方法及新策略有重要意義[7]。千金藤素為一種雙芐基異喹啉型生物堿，是從防己科千金藤屬植物千金藤中提取分離出來(lái)的有效成分。千金藤素具有多種藥理作用，其抗腫瘤作用近年來(lái)研究較多，它可通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤的預(yù)防和治療，包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性等。

Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅱin the ovarian cancer SKOV3 cells treated with cepharanthine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3 千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

自噬是在應(yīng)激條件下參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過(guò)程，其功能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著不可忽略的作用[8]。本研究應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，cepharanthine能明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力，吖啶橙染色結(jié)果顯示經(jīng)cepharanthine藥物干預(yù)后細(xì)胞中酸性自噬泡染成紅色比例顯著增多，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示cepharanthine作用后自噬相關(guān)蛋白分子LC3-II的表達(dá)水平顯著升高。這些結(jié)果說(shuō)明了cepharanthine能誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞發(fā)生自噬。然而，自噬作為一把“雙刃劍”，它可以是細(xì)胞在應(yīng)激條件下的一種保護(hù)反應(yīng)，也可以啟動(dòng)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[9-10]。為了明確自噬在該藥物的抑瘤過(guò)程中起到的作用，我們采用自噬抑制劑3-MA提前孵育SKOV3 細(xì)胞1 h以阻斷自噬的作用。CCK-8法檢測(cè)cepharanthine聯(lián)用自噬抑制劑3-MA后SKOV3細(xì)胞活力的變化[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3-MA與cepharanthine聯(lián)合給藥干預(yù)下，與對(duì)照組相比，3-MA 促進(jìn)了cepharanthine對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。這表明cepharanthine誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞發(fā)生自噬是細(xì)胞自身的一種保護(hù)性機(jī)制，使用自噬抑制劑能增強(qiáng)cepha-ranthine對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的殺傷作用。然而，cepharanthine誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚不清楚。

Figure 4.The protein levels of p-mTOR and p-AKT in the ovarian cancer SKOV3 cells treated with cepharanthine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4 千金藤素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

目前已發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬的信號(hào)通路有很多，其中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是研究最為廣泛的信號(hào)通路之一[12-13]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，PI3K激酶被激活，然后通過(guò)激活A(yù)KT磷酸化，進(jìn)而激活下游的mTOR等信號(hào)分子，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，其核心蛋白 mTOR的活化是決定自噬體形成和成熟的關(guān)鍵蛋白[14-15]。抑制mTOR的功能，使PI3K/AKT/mTOR通路失活，則可以誘導(dǎo)自噬[16]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在cepharanthine作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，AKT及下游蛋白mTOR的磷酸化表達(dá)隨cepharanthine濃度增高而逐漸降低，這說(shuō)明cepharanthine可能與抑制PI3K/AKT/mTOR通路導(dǎo)致卵巢癌SKOV3細(xì)胞發(fā)生自噬。本研究雖證明了cepharanthine能夠通過(guò)抑制 PI3K/AKT/mTOR通路導(dǎo)致卵巢癌SKOV3細(xì)胞發(fā)生自噬，但其具體作用機(jī)制還需繼續(xù)深入研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證cepharanthine是否通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 通路導(dǎo)致卵巢癌SKOV3細(xì)胞發(fā)生自噬。

Figure 5.Combination of cepharanthine and 3-MA resulted in a substantial decrease in the cell viability compared with using cepharanthine alone. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vscepharanthine 8 μmol/L group;&&P<0.01vscepharanthine 16 μmol/L group.

圖5 千金藤素聯(lián)用3-MA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)自噬溶酶體、自噬標(biāo)志物以及相關(guān)的信號(hào)通路，初步研究表明cepharanthine能誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬，并且該作用可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。這為cepharanthine應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。