李宏軍，施 源，何 敏，李 堅(jiān)，王君君，鄧新超，魯 密，張 輝，吳 巖，吳紅麗，梁 平

(武漢市第八醫(yī)院，湖北 武漢 430010)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)作為全球范圍內(nèi)最常見的關(guān)節(jié)炎之一，伴隨有炎癥、組織結(jié)構(gòu)病變、疼痛和關(guān)節(jié)功能喪失等癥狀，給患者日常生活帶來了極大的痛苦[1]。KOA還是一種慢性老年性疾病，女性發(fā)病率高于男性，隨著全球老年化的加速，KOA成為引起老年人殘障的主要疾病之一[2-3]。因此控制和治療KOA顯得尤為重要。

國內(nèi)外KOA治療方法包括西藥治療、手術(shù)治療和傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療等。西藥治療效果存在局限性，只可在短期內(nèi)緩解癥狀。手術(shù)治療主要為膝關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)清理術(shù)及綜合治療和全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，具有良好的治療效果但均存在著一系列術(shù)后并發(fā)癥[4]。傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法包括內(nèi)治法、中藥外治法和針灸治療等，其中中藥外治法主要有中藥貼敷、中藥涂抹、中藥熱敷、中藥熏洗和中藥蠟療等[5]。作者前期研究結(jié)果初步表明，中藥(千草方)熏洗聯(lián)合關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)能夠有效緩解KOA[6]，但有關(guān)千草方熏洗治療KOA的機(jī)制還鮮少研究。已有的研究結(jié)果表明，Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)對軟骨細(xì)胞具有抗凋亡和促增殖的作用[7]，而且YAP還能夠作用于TGF-β/Smad信號通路[8]。Smad3也被證明與軟骨細(xì)胞肥大等相關(guān)[9]。因此，本研究旨在探討千草方熏洗對KOA軟骨中YAP/Smad3信號通路的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

II型膠原C端肽(C-telopeptide of type II collagen，CTX-II)和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)ELISA試劑盒購自Bio-Swamp；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購自Roche；抗YAP(ab205270)、高遷移率族蛋白B2(high mobility group protein B2，HMGB2)(ab11973)、Smad3(ab40854)、骨成型蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)(ab14933)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab59348)和β-actin(ab8226)抗體購自Abcam；透明質(zhì)酸鈉(國藥準(zhǔn)字H10960136)購自山東正大福瑞達(dá)制藥有限公司；千草方由武漢市中醫(yī)醫(yī)院中藥藥房提供。

2 動物分組及處理

10周齡SPF級雄性SD大鼠32只，體重(300～350)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證編號為11401300043471。動物實(shí)驗(yàn)方案通過武漢市第八醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。大鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)，自由獲得干凈飲用水和商業(yè)飼料，溫度(23～25) ℃，相對濕度50%左右，12 h光照。飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照(control)組、造模(model)組、中藥(Chinese medicine)組和HA組，每組8只。采用改良Hulth法建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉大鼠，無菌條件下切除大鼠右膝內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶，術(shù)后3 d每日大鼠肌內(nèi)注射青霉素20 U/d預(yù)防感染。

3 主要方法

3.1HA注射 于動物模型制備后的第1周開始關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉(0.4 mL/kg)，其后每周重復(fù)注射1次，共5次(嚴(yán)格無菌操作)。

3.2中藥熏洗 于動物模型制備后的第1天開始進(jìn)行中藥熏洗，具體方法為千草方置于蒸發(fā)器內(nèi)，加水至2～2.5 L，加米醋50 mL，藥液濃度為10%，接通電源加熱，產(chǎn)生蒸汽，溫度為40 ℃～45 ℃，將患膝(熏洗部位以膝關(guān)節(jié)髕骨為中心，上、下各約3 cm)置蒸汽上，每次30 min，每天1次，30 d為一療程。

3.3取材 所有動物于治療完成1周后，斷頸處死，在無菌條件下立即打開膝關(guān)節(jié)，以銳利刀片矢狀位切取股骨內(nèi)側(cè)髁及脛骨平臺約3 mm厚關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，保存于10%多聚甲醛中待測。

3.4HE染色 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于10%多聚甲醛4 ℃固定48 h后，放入20% EDTA液，于4 ℃冰箱內(nèi)脫鈣4周，每3 d換脫鈣液1次。然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片。切片脫蠟脫水后進(jìn)行常規(guī)HE染色。HE染色過程如下，蘇木素染核15 min，流水沖洗1 min，靜水放置5 min，0.5%伊紅染液3 min，流水沖洗。HE切片在光學(xué)顯微鏡下使用雙盲法按Mankin’s法對關(guān)節(jié)軟骨評分[10]。

3.5血清指標(biāo)的檢測 所有的動物均于治療完成1周后，于腹主動脈穿刺取血10 mL，4 ℃密封保存8 h，6 000 r/min 離心15 min，收集血清于EP管，保存于-20 ℃的低溫冰箱待測。采用ELISA法測定血清中CTX-II和COMP的水平。

3.6TUNEL染色 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于10%多聚甲醛，4 ℃固定48 h后，放入20% EDTA液于4 ℃冰箱內(nèi)脫鈣4周，每3 d換脫鈣液1次。然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片。切片脫蠟脫水后進(jìn)行TUNEL染色。TUNEL染色過程如下，蛋白酶K室溫處理30 min，0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波爐修復(fù)抗原。切片用TUNEL反應(yīng)混合液處理后，加入DAB溶液顯色，最后用蘇木精復(fù)染核，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡情況。

3.7免疫組化染色 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于10%多聚甲醛, 4 ℃固定48 h后，放入20% EDTA液于4 ℃冰箱內(nèi)脫鈣4周，每3 d換脫鈣液1次。然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片。切片脫蠟脫水后進(jìn)行免疫組化染色，具體方法為切片脫蠟脫水后烤片3 min，滴加3% H2O2抗原修復(fù)，滴加BSA，滴加抗YAP(1∶2 000)和HMGB2(1∶500)的I抗孵育過夜，滴加對應(yīng)的II抗，加2滴新鮮配制的DAB溶液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.8Western blot實(shí)驗(yàn) RIPA裂解液提取膝骨關(guān)節(jié)軟骨總蛋白。NanoDrop 2000測定蛋白含量。以50 μg蛋白上樣，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下用含2.5%脫脂奶粉的PBST封閉，加入抗YAP(1∶1 000)、Smad3(1∶3 000)、BMP2(1∶1 000)、Bax(1∶3 000)、Bcl-2(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 500)，4 ℃孵育過夜。加入對應(yīng)的II抗，室溫孵育2 h，ECL法顯色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19.0，作圖采用GraphPad Prism 5。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，3組及3組以上樣本之間采用多因素方差分析進(jìn)行組間比較，進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織形態(tài)學(xué)觀察

各組大鼠軟骨組織HE染色結(jié)果顯示，對照組軟骨表面光滑，軟骨基質(zhì)著色均勻，為粉色，軟骨細(xì)胞核為藍(lán)色；各層細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整。模型組軟骨表面粗糙破損，表層軟骨糜爛、剝落；軟骨基質(zhì)著色不均勻，各層細(xì)胞排列紊亂，4層結(jié)構(gòu)不清晰。與模型組相比，中藥組軟骨表面更加光滑，雖然軟骨細(xì)胞減少，但結(jié)構(gòu)較清晰，軟骨基質(zhì)著色較均勻。HA組軟骨細(xì)胞亦減少，但結(jié)構(gòu)較為完整和清晰，見圖1。

Figure 1.The result of HE staining in cartilage tissues (×200).

圖1 軟骨組織HE染色結(jié)果

2 膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin’s評分結(jié)果

與對照組比較，模型組Mankin’s評分值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組和HA組Mankin’s評分值顯著降低(P<0.05)，見圖2。

3 中藥熏洗對血清指標(biāo)的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，模型組血清COMP的表達(dá)量顯著增加，CTX-II的表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與模型組相比，中藥組和HA組血清COMP的表達(dá)量顯著降低，CTX-II的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The result of Mankin’s score. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 Mankin’s評分結(jié)果

4 中藥熏洗對軟骨細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，對照組軟骨細(xì)胞無明顯凋亡，凋亡率為5.63%±1.16%；與對照組相比，模型組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)大面積的凋亡，凋亡率顯著升高至61.35%±3.05%(P<0.01)；與模型組相比，中藥組(21.74%±1.88%)和HA組(28.13%±2.03%)軟骨細(xì)胞的凋亡率明顯下降(P<0.05)，見圖4。

5 中藥熏洗對YAP和HMGB2表達(dá)的影響

軟骨組織免疫組化的結(jié)果表明，模型組軟骨組織YAP表達(dá)量低于對照組，采用中藥熏洗和HA注射治療后，YAP的表達(dá)量增加(P<0.05),見圖5。模型組軟骨組織HMGB2表達(dá)量低于對照組，采用中藥熏洗和HA注射治療后，HMGB2的表達(dá)量升高(P<0.05)，見圖6。

Figure 3.The effect of herbal fumigation on the serum levels of COMP and CTX-II. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 中藥熏洗對血清COMP和CTX-II含量的影響

Figure 4.The result of TUNEL staining in cartilage tissues (×200).

圖4 軟骨組織TUNEL染色結(jié)果

Figure 5.The immunohistochemical results of YAP (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

圖5 YAP免疫組化染色結(jié)果

Figure 6.The immunohistochemical result of HMGB2 (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

圖6 HMGB2免疫組化染色結(jié)果

6 中藥熏洗對YAP、Smad3和BMP2蛋白表達(dá)量的影響

與對照組相比，模型組BMP2的表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與模型組相比，中藥組和HA組BMP2的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。與對照組相比，模型組YAP和Smad3的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，中藥組和HA組YAP和Smad3的表達(dá)量顯著增加(P<0.05),見圖7。

7 中藥熏洗對凋亡信號通路的影響

與對照組相比，模型組Bax的表達(dá)量顯著增加，Bcl-2的表達(dá)量顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，中藥組和HA組Bax的表達(dá)量顯著下降，Bcl-2的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，見圖7。

討 論

“痹者，閉也”、“不通則痛”，根據(jù)我們在臨床的多年觀察，我們認(rèn)為KOA屬本虛標(biāo)實(shí)之癥，正如《濟(jì)生方·痹》所云：“皆因體虛，腆理空虛，感受風(fēng)寒濕氣而成痹也”，《素問·痹證論》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也，其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹”。根據(jù)臨床癥狀我們認(rèn)為其標(biāo)實(shí)為主要癥狀，根據(jù)“急則治其標(biāo)，緩則治其本”應(yīng)首先解除患者標(biāo)實(shí)之病因——風(fēng)寒濕邪。臨床中的辨證分型主要集中在風(fēng)寒濕阻、氣滯血淤、痰淤互結(jié)、痰濕阻絡(luò)和肝腎虧虛等證型，根據(jù)《景岳全書·本草篇》“除風(fēng)濕，行血脈，壯筋骨……治骨節(jié)四肢拘攣，兩腳痹痛”，在治療上采用散寒去濕、發(fā)汗解表、疏通膜理、調(diào)和氣血、舒經(jīng)活絡(luò)的“千草方”局部薰洗，達(dá)到緩解膝部疼痛、恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的活動功能，抑制退行性病變進(jìn)一步發(fā)展的目的。我們的前期研究結(jié)果表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸聯(lián)合千草方熏洗能夠緩解關(guān)節(jié)軟骨的破壞并降低炎癥[6]，但千草方熏洗緩解KOA的相關(guān)分子機(jī)制還不甚了解。因此，本研究構(gòu)建了SD大鼠KOA模型，并用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA和千草方熏洗分別對KOA大鼠進(jìn)行了治療，旨在研究千草方熏洗對YAP/Smad3通路的影響。

Figure 7.Relative protein expression of YAP, Smad3, BMP2, Bax and Bcl-2 in each group was detected by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖7 Western blot檢測各組軟骨組織中YAP、Smad3、BMP2、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

KOA的主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、脫落和炎癥因子沉積等諸多改變[11]。尿液和血液中CTX-II和COMP濃度是反映骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的有效標(biāo)志物[12-13]。本研究中，HE染色和Markin’s評分及血清中CTX-II和COMP含量的結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了KOA模型。通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA或千草方熏洗治療后，能夠緩解軟骨組織結(jié)構(gòu)的破壞和炎癥浸潤等。為了進(jìn)一步研究千草方熏洗治療KOA的分子機(jī)制，我們測定了各組軟骨細(xì)胞的凋亡情況，檢測了軟骨組織中HMGB2、YAP、Smad3、BMP2、Bax和Bcl-2的表達(dá)。在正常關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生率很低，而在KOA關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生明顯增高[14]。在本研究中，KOA模型組軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)出嚴(yán)重的凋亡，而HA組和中藥組的軟骨細(xì)胞凋亡率與模型組比較顯著降低。同時(shí)，Westem blot結(jié)果表明，與模型組比較，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量在HA組和中藥組中顯著下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量在HA組和中藥組中顯著上調(diào)，說明進(jìn)行千草方熏洗能有效抑制KOA軟骨細(xì)胞的凋亡。HMGB2屬于HMGB家族，研究發(fā)現(xiàn)HMGB2在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中處于低表達(dá)的狀態(tài)[15]，而且HMGB2作為核心因子對維持軟骨細(xì)胞分泌表征和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性起著積極作用[16]。本研究結(jié)果與上述研究發(fā)現(xiàn)一致，模型組HMGB2的表達(dá)量下降，而HA組和中藥組HMGB2的表達(dá)量增加，說明千草方能夠通過促進(jìn)HMGB2高表達(dá)從而發(fā)揮維持軟骨穩(wěn)定性的作用。BMP2屬于BMP家族，具有多向分化的潛能，其促進(jìn)軟骨向成骨分化的能力尤其強(qiáng)大[17]。本研究中，模型組BMP2表達(dá)量增加而HA組和中藥組HMGB2的表達(dá)量下降，說明千草方能夠通過抑制BMP2發(fā)揮維持軟骨穩(wěn)定性的作用。本研究中，模型組YAP和Smad3的表達(dá)量下降而HA組和中藥組YAP和Smad3的表達(dá)量增加，說明千草方能夠通過促進(jìn)YAP/Smad3高表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，并抑制了軟骨細(xì)胞凋亡和發(fā)生肥大。大量研究表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA具有抗炎、保護(hù)軟骨和改善關(guān)節(jié)功能等作用[18]。本次研究的結(jié)果顯示千草方熏洗和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA，都抑制了軟骨細(xì)胞的凋亡，維持軟骨穩(wěn)定性。由此推測，千草方熏洗對膝骨關(guān)節(jié)炎的治療具有與關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA相似的效果。

綜上所述，千草方熏洗能夠通過YAP/Smad3信號通路緩解KOA，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨組織結(jié)構(gòu)的破壞，為千草方治療KOA提供分子基礎(chǔ)。