胡 玥，陳超英，張 夢(mèng)，呂 賓

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310006)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)作為一種臨床常見(jiàn)的胃腸功能紊亂性疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前研究指出腹瀉型IBS患者存在小腸和結(jié)腸腸黏膜屏障的損傷[2-4]。因此，保護(hù)腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能完整在防治腹瀉型IBS中有著重要的意義。同時(shí)，應(yīng)激在IBS的發(fā)病中的作用被日益關(guān)注，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)作為應(yīng)激反應(yīng)中最重要的內(nèi)分泌激素，已被發(fā)現(xiàn)可以引起腸上皮細(xì)胞通透性的改變[5-6]，參與IBS的發(fā)病。此外，在我們前期研究中，應(yīng)激IBS大鼠結(jié)腸黏膜存在細(xì)胞角蛋白8(cytokeratin 8，CK8)的表達(dá)上調(diào)[7]，且伴有肌動(dòng)蛋白重構(gòu)及緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)分布紊亂。由此，本研究旨在明確CRF是否是通過(guò)上調(diào)CK8破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接引起腸上皮通透性改變及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為闡明腹瀉型IBS的發(fā)病機(jī)制及其臨床有效診治提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，2～3 d 傳代1次。當(dāng)HT29細(xì)胞生長(zhǎng)并融合形成單層約60%～70%左右，給予100 nmol/L CRF處理，72 h后行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；抗CK8抗體及PKC活性試劑盒購(gòu)自Abcam；抗ZO-1抗體購(gòu)自L(fǎng)ife；抗occludin抗體購(gòu)自CST；抗CRF受體1(CRF receptor 1，CRFR1)及CRFR2 抗體購(gòu)自Anbobio；Cy3標(biāo)記的山羊抗兔 IgG (H+L) II 抗購(gòu)自Sigma；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)購(gòu)自Southern Biotech；CRF購(gòu)自Tocris Bioscience；抗兔 II 抗購(gòu)自上海明睿生物技術(shù)有限公司；TRIzol及PCR試劑購(gòu)自TaKaRa；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega。

3 主要方法

3.1sh-CK8慢病毒轉(zhuǎn)染 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成(3～5)×107/L細(xì)胞懸液，將2 mL細(xì)胞懸液接種到6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時(shí)鋪板量達(dá)到15%～30%左右。待細(xì)胞密度為每孔20%時(shí)更換感染培養(yǎng)基(Eni.S+polybrene)，將CK8干擾慢病毒LV-KRT8-RNAi(37991-1)和陰性對(duì)照(negative control,NC)病毒CON053按MOI值20分別加入培養(yǎng)體系中進(jìn)行感染。感染后16 h更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并分為sh-NC組和sh-CK8組。感染后72 h，給予100 nmol/L CRF處理，72 h后行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

3.2免疫熒光檢測(cè)HT29細(xì)胞表面CRFR1和CRFR2的表達(dá)情況 將各組HT29細(xì)胞調(diào)整至每孔5×105，接種于已放圓形爬片的24孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，去培養(yǎng)基，按固定、洗滌、封閉、洗滌的順序處理爬片，分別孵育抗CRFR1(1 ∶50)、CRFR2(1 ∶50)和CK8(1 ∶25 000)的I抗在濕盒中4 ℃過(guò)夜，洗滌后在避光環(huán)境中，以1 ∶400比例孵育Cy3標(biāo)記的II抗，PBS洗滌，加入DAPI及抗淬滅劑封片，隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。

3.3Real-time PCR 將各組HT29細(xì)胞以TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以此cDNA為模版用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)CK8的mRNA表達(dá)情況。GAPDH 的上游引物序列為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，擴(kuò)增片段為 121 bp；CK8的上游引物序列為5’-ACAAGTTTGCCTCCTTCATAGA-3’，下游引物序列為5’-GAGGACAAATTCGTTCTCCAT-3’，擴(kuò)增片段為287 bp。反應(yīng)參數(shù)為：95.0 ℃ 30 s; 95.0 ℃ 5 s、60.0 ℃ 34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，60 ℃～95 ℃緩慢升溫，產(chǎn)生熔解曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的基因和內(nèi)參照GAPDH的Ct比值來(lái)描述。

3.4Western blot 收集各組HT29細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白；以BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度，上樣于10%SDS-PAGE，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別孵育CK8(1 ∶25 000)、ZO-1(1 ∶125)及occludin(1 ∶50 000)的I抗4 ℃過(guò)夜，次日抗兔 II 抗室溫孵育2 h，凝膠成像分析儀進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，數(shù)據(jù)由Quantity One軟件分析。

3.5細(xì)胞旁通透性的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組HT29細(xì)胞，按1×105的密度接種到Transwell 培養(yǎng)板上，待Transwell板中細(xì)胞形成緊密單層后，按100 nmol/L的CRF加入培養(yǎng)基中，72 h后于Transwell上室加入1 g/L dextran-FITC 100 μL，下室加入500 μL PBS，避光置于37 °C恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中, 分別于0.5 h、1 h和2 h后從Transwell板底部取100 μL PBS，置于96孔板上，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)量濃度，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定在 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定在 525 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算dextran-FITC濃度。

3.6電鏡觀(guān)察 將2組細(xì)胞調(diào)整至每孔1×105接種于6孔板，加藥72 h后用細(xì)胞刮器將細(xì)胞刮下后固定細(xì)胞于2.5%戊二醛內(nèi)(>48 h)。按漂洗、固定、脫水、包埋，聚合、修塊和切片染色順序處理細(xì)胞。染色后將超薄切片放至單孔銅網(wǎng)上，電鏡觀(guān)察條件：Tecnai 10透射電鏡，高壓80 kV，照相。

3.7蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)活性的測(cè)定 對(duì)HT29細(xì)胞培養(yǎng)至90%融合，加100 nmol/L CRF分別于5 min、10 min、30 min、1 h和2 h收集細(xì)胞樣本，加入裂解液裂解細(xì)胞，收集并測(cè)定蛋白濃度。按照PKC活性試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算PKC活性。并根據(jù)此次結(jié)果，采用100 nmol/L CRF處理慢病毒感染后的各組HT29細(xì)胞并收集細(xì)胞樣本，進(jìn)行PKC活性檢測(cè)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HT29細(xì)胞表面CRF受體的表達(dá)

激光共聚焦顯微鏡顯示，紅色為CRFR1及CRFR2特異熒光，藍(lán)色為DAPI核染，提示HT29表面存在CRFR1及CRFR2表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of CRFR1 and CRFR2 in the HT29 cells was examined by immunofluorescence staining(×200). CRFR1 and CRFR2 expression on the HT29 cell membrane was examined after stained with Cy3-labelled antibodies (red). DAPI was used to counterstain the nucleus (blue).

圖1 HT29細(xì)胞株CRFR1及CRFR2免疫熒光染色觀(guān)察

2 CRF對(duì)HT29細(xì)胞旁通透性及細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，HT29細(xì)胞在給予100 nmol/L CRF 0.5 h，細(xì)胞通透性改變的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而給藥1 h和2 h時(shí)，細(xì)胞通透濃度均增加(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。電鏡觀(guān)察結(jié)果提示，對(duì)照組的HT29細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)完整，通道關(guān)閉，連接致密(黃色剪頭所示)，而100 nmol/L CRF處理后細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)不完整，連接疏松，通道開(kāi)放(紅色剪頭所示)，見(jiàn)圖2B。

3 CRF對(duì)HT29細(xì)胞CK8及緊密連接蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果提示，與對(duì)照組對(duì)比，CRF處理后 HT29細(xì)胞CK8的蛋白表達(dá)上調(diào)，而occludin及ZO-1的蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。共聚焦顯微鏡提示，紅色為CK8特異熒光，藍(lán)色為DAPI核染，與對(duì)照組相比，CRF處理后，HT29細(xì)胞表面CK8熒光強(qiáng)度增加，并在細(xì)胞膜上聚集，見(jiàn)圖3B。

4 PKC活性的變化

與對(duì)照組相比，HT29細(xì)胞在CRF處理后1 h PKC活性降低最為顯著(0.44±0.05vs0.27±0.05，P<0.05)。

Figure 2.The effects of CRF on the paracellular permeability and ultrastructure of tight junctions (TJs) in the HT29 cells. A: the parancellular permeability of HT29 cells, as indicated by dextran-FITC, was mea-sured using a fluorescence spectrophotometer; B: the ultrastructure of TJs was observed under a transmission electron microscope(×8 300). The cells in CRF group were treated with 100 nmol/L CRF for 72 h. TJs were shown by arrows. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsthe respective control group.

圖2 CRF對(duì)HT29細(xì)胞旁通透性及緊密連接結(jié)構(gòu)的影響

5 CK8基因沉默

Real-time PCR結(jié)果顯示，sh-CK8組CK8 mRNA的表達(dá)水平(0.12±0.004)顯著低于對(duì)照組(1.24±0.05)和sh-NC組(1.00±0.08)(P<0.05)。Wes-tern blot結(jié)果顯示，sh-CK8組CK8蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和sh-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。這提示感染sh-CK8慢病毒可顯著降低CK8的蛋白表達(dá)水平。

6 CK8沉默后CRF對(duì)HT29細(xì)胞旁通透性及相關(guān)蛋白的影響

Transwell結(jié)果提示，CK8沉默后，sh-NC和sh-CK8組給予100 nmol/L CRF處理72 h，在2 h細(xì)胞通透濃度分別為(41.04±1.33) mg/L和(40.58±1.63)mg/L，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果表明，sh-CK8+CRF組ZO-1的表達(dá)對(duì)比sh-CK8組無(wú)明顯差異，而sh-NC+CRF組ZO-1的表達(dá)明顯低于sh-CK8+CRF組(P<0.05)，見(jiàn)圖5A； CRF處理后，各組occludin則表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5B。在CRF處理1 h后，sh-NC+CRF組PKC活性對(duì)比sh-NC組及sh-CK8+CRF組顯著降低(0.48±0.01vs0.41±0.01，P<0.05)，sh-CK8+CRF組PKC活性較sh-CK8組無(wú)明顯差異(0.43±0.004vs0.45±0.04，P>0.05)。

討 論

IBS是臨床常見(jiàn)的功能性胃腸病，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)[8]。近年來(lái)，精神心理因素在IBS發(fā)病中的作用日益受到人們的關(guān)注，作為機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要介質(zhì)，CRF廣泛分布于人類(lèi)胃腸道，并通過(guò)與其受體CRFR1、CRFR2以及CRF肽類(lèi)家族相結(jié)合，參與應(yīng)激相關(guān)胃腸道功能異常，包括內(nèi)臟高敏感、腸道動(dòng)力異常以及腸道黏膜通透性改變等[9-11]。有研究證實(shí)，急性應(yīng)激釋放的CRF能夠直接作用于肥大細(xì)胞脫顆粒，通過(guò)分泌炎癥介質(zhì)改變黏膜通透性，引起腸屏障功能的破壞以加重IBS腹瀉癥狀[12-13]。其中，腸上皮緊密連接作為腸黏膜屏障中最重要的連接方式，能夠通過(guò)維持上皮細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及修復(fù)上皮細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸來(lái)調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的通透性[14-16]。而跨膜蛋白o(hù)ccludin及細(xì)胞質(zhì)蛋白ZO-1是形成腸上皮緊密連接的關(guān)鍵蛋白，通過(guò)與肌動(dòng)蛋白結(jié)合而參與維持其功能穩(wěn)定[14, 17]。同時(shí)，應(yīng)激IBS動(dòng)物模型腸黏膜高表達(dá)的CK8，屬上皮細(xì)胞骨架蛋白，在維持胃腸道上皮的結(jié)構(gòu)和功能方面扮演著重要的角色，與緊密連接相關(guān)蛋白之間存在緊密聯(lián)系[10, 18]。因此，探明CRF-CK8途徑與IBS的腸黏膜通透性改變之間的關(guān)系，可以為明確IBS的病理生理機(jī)制提供新的視角。

本研究證實(shí)，CRF能夠引起腸上皮細(xì)胞旁通透性的梯度增加，緊密連接通道開(kāi)放，結(jié)構(gòu)疏松，同時(shí)伴隨CK8的表達(dá)上調(diào)，并在胞質(zhì)內(nèi)呈顆粒樣改變；而緊密連接蛋白ZO-1和occludin均出現(xiàn)表達(dá)降低，表明應(yīng)激相關(guān)因子CRF不僅可以引起CK8表達(dá)上調(diào)和分布改變，同時(shí)伴有緊密連接超微結(jié)構(gòu)破壞，及其相關(guān)蛋白在表達(dá)水平的不同變化，最終引起腸上皮屏障通透性增高。然而CK8基因沉默卻并不能阻斷CRF引起的腸上皮細(xì)胞通透性增加，細(xì)究其具體蛋白變化，我們發(fā)現(xiàn)occludin的蛋白表達(dá)仍下調(diào)，但ZO-1的表達(dá)下降被成功抑制。我們知道，緊密連接蛋白按分布部位的不同，分為2類(lèi)：一類(lèi)為細(xì)胞膜蛋白，存在于細(xì)胞膜上，通常為跨膜結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成選擇性屏障功能的結(jié)構(gòu)蛋白；另一類(lèi)為細(xì)胞質(zhì)蛋白，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，能與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，起連接膜蛋白與細(xì)胞骨架或傳遞信號(hào)分子的作用[14]。有研究指出，胞質(zhì)蛋白ZO-1在穩(wěn)定上皮緊密連接中具有關(guān)鍵作用，其PDZ區(qū)域可與跨膜蛋白o(hù)ccludin相互連接并相互作用，一旦ZO-1發(fā)生破壞，緊密連接的功能多隨之改變[15, 19-21]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測(cè)CRF能夠通過(guò)上調(diào)CK8介導(dǎo)腸上皮緊密連接ZO-1低表達(dá)來(lái)增加腸上皮通透性。但本研究中，occludin在給予CRF刺激后蛋白表達(dá)仍下調(diào)，同時(shí)，腸上皮細(xì)胞通透性也未見(jiàn)明顯差異，這說(shuō)明CRF對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接的破壞是多途徑的，即使阻斷了CRF-CK8途徑，但由于仍存在跨膜緊密連接蛋白的破壞，因此并不能逆轉(zhuǎn)CRF刺激后腸上皮通透性的增加。

Figure 3.The effects of CRF (100 nmol/L for 72 h) on the expression and distribution of CK8 and tight junction proteins in HT29 cells. A: Western blot analysis of CK8, occludin, and ZO-1 expression in the HT29 cells with or without CRF treatment; B: the expression levels of CK8 in the HT29 cells examined under confocal microscope(×3 000). The HT29 cells were stained with Cy3-labelled antibody against CK8 (red). DAPI was used to counterstain the nucleus (blue). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖3 CRF對(duì)HT29細(xì)胞CK8及緊密連接蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The protein expression of CK8 in the HT29 cells infected with sh-CK8 lentivirus. Western blot analysis revealed the significant down-regulation of CK8 protein expression in the sh-CK8 group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vssh-NC group.

圖4 基因沉默后CK8蛋白的表達(dá)

PKC屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶超家族一員，通過(guò)介導(dǎo)下游信號(hào)通路，參與細(xì)胞活化、增殖及分化等多種生物學(xué)功能。而大量研究顯示，PKC介導(dǎo)的信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)緊密連接蛋白表達(dá)分布改變，直接調(diào)節(jié)緊密連接而在上皮屏障中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，ZO-1和occludin等緊密連接相關(guān)蛋白上存在PKC的定位位點(diǎn)[22]。有研究報(bào)道，佛波酯刺激人結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞T84細(xì)胞株24 h后，可以引起PKC活性下調(diào)并與其上皮通透性增加相關(guān)[23]。而本研究亦發(fā)現(xiàn)，CRF 刺激1 h后PKC活性明顯下降。同時(shí)，CK8被報(bào)道可能參與PKC信號(hào)通路調(diào)控肌動(dòng)蛋白的改變[24]，因此，在CK8基因沉默后CRF并不能引起PKC活性的下調(diào)。由此，我們推測(cè)，CRF可能通過(guò)上調(diào)CK8抑制PKC途徑介導(dǎo)緊密連接ZO-1低表達(dá)及結(jié)構(gòu)紊亂參與調(diào)節(jié)腸上皮通透性改變。

結(jié)合已有的研究結(jié)果，我們認(rèn)為CRF引起的腸上皮通透性增加可能與CK8表達(dá)增加有關(guān)，即CRF作用于腸上皮細(xì)胞可上調(diào)CK8表達(dá)，從而抑制PKC信號(hào)通路，降低緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)。同時(shí)亦存在其它途徑共同參與CRF導(dǎo)致的腸上皮屏障受損，具體機(jī)制待進(jìn)一步闡明。

Figure 5.The effects of CRF (100 nmol/L for 72 h) on the expression of tight junction-related proteins inCK8-silencing HT29 cells were detected by Western blot analysis. A: Western blot analysis was used to determine the protein expression of ZO-1 in sh-NC and sh-CK8 HT29 cells with or without CRF treatment; B: Western blot analysis was used to determine the protein expression of occludin in the sh-NC and sh-CK8 HT29 cells with or without CRF treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssh-NC group;##P<0.05vssh-NC+CRF group.

圖5 CRF對(duì)CK8基因沉默后HT29細(xì)胞ZO-1及occludin蛋白表達(dá)的影響