謝發(fā)江，蔣松辰，高尚遠(yuǎn)，李 燕，冉茂霞，李家富，馮 健

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)系糖尿病(diabetes mellitus,D)患者中獨立于大血管及微血管病變的特異性心肌損害，是發(fā)達(dá)國家糖尿病患者致死的主要原因之一[1]。長期高血糖刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大及纖維化，早期可出現(xiàn)心臟舒張功能下降，并逐漸累及收縮功能，最終發(fā)展為充血性心力衰竭[2]。

炎癥和纖維化是DCM發(fā)病的重要機(jī)制之一，單核-巨噬細(xì)胞滲出及分化是炎癥啟動及調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，巨噬細(xì)胞受局部微環(huán)境的影響至少分化為2種亞型參與炎癥反應(yīng)，這一過程稱之為巨噬細(xì)胞極化，其中以經(jīng)典活化型(M1型)巨噬細(xì)胞和選擇活化型(M2 型)巨噬細(xì)胞為主，M1型巨噬細(xì)胞上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及炎癥因子的表達(dá)，過度極化可導(dǎo)致組織損傷，M2型巨噬細(xì)胞上調(diào)精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1)及抗炎因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)，有利于組織修復(fù)[3]。M1/M2比例失調(diào)促進(jìn)DCM發(fā)生，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化顯示了良好的抗纖維化及對DCM的治療作用[4-7]。

RhoA蛋白是Ras超家族中一種小分子三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合蛋白，其下游效應(yīng)分子為Rho激酶(Rho-associated kinases，ROCK)，后者屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，存在2種亞型: ROCK1(又稱ROKβ、p160 ROCK)和ROCK2(也稱ROKα)。RhoA/ROCK信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為，扮演分子開關(guān)的角色[8]。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激、鈣平衡、胰島素抵抗、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化和心臟舒縮功能等參與DCM發(fā)病，是具有巨大潛力的治療靶點[9]。法舒地爾能特異性結(jié)合ROCK中ATP依賴的激酶結(jié)構(gòu)域并抑制其活性，是目前臨床上唯一批準(zhǔn)使用的ROCK抑制劑，因其強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用而被廣泛應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔出血和缺血性心臟病等血管痙攣性疾病的治療中[10-11]。盡管動物實驗結(jié)果顯示法舒地爾能夠抗心肌纖維化進(jìn)而治療DCM[12-13]，但其深入機(jī)制是否與通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化相關(guān)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型并給予法舒地爾干預(yù)，觀察其對巨噬細(xì)胞極化及心肌纖維化的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、藥品與試劑

60只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重(20.6±0.8)g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，合格證編號為SCXK(川)2015-030。實驗期間自由飲水，進(jìn)食普通飼料，室溫(23±1)℃，每日12 h光照維持晝夜循環(huán)。

鏈脲佐菌素購自Sigma；鹽酸法舒地爾(hydroxyl fasudil,HF)注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司(批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H20040356)；抗CD11c和CD206抗體均購自Proteintech Group；抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和IL-10抗體均購自Bioworld Technology；抗p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1抗體均購自CST；抗β-actin抗體、山羊抗兔II抗和山羊抗鼠II抗購自Abcam；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物公司。

2 方法

2.1糖尿病小鼠模型的建立、分組及處理 所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組(normal saline組，NS組)、正常+法舒地爾組(N+HF組)、糖尿病組(D+NS組)、法舒地爾低劑量組(D+LHF組)、法舒地爾中劑量組(D+MHF組)和法舒地爾高劑量組(D+HHF組)，每組各10只。D+NS組及各治療組小鼠禁食12 h后，腹腔注射1% STZ (80 mg/kg)，NS組和N+HF組小鼠腹腔注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)7 d，2周后斷尾取血，測得血糖值≥16.7 mmol/L視為造模成功。成模后各治療組小鼠分別腹腔注射低劑量(10 mg/kg)、中劑量(40 mg/kg)和高劑量(60 mg/kg)法舒地爾，每天1次[14]，N+HF組予中劑量(40 mg/kg)法舒地爾，NS組和D+NS組腹腔注射等體積生理鹽水，連用8周，復(fù)測隨機(jī)血糖及體重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸取心臟，將其橫向?qū)Π肭虚_，心尖部組織用4%多聚甲醛固定后制作成厚4 μm石蠟切片，心底部組織凍存于-80 ℃冰箱，用于Western blot檢測。

2.2心臟組織病理學(xué)觀察 分別選取各組石蠟切片，脫蠟至水，行HE及Masson染色，于光鏡下觀察拍照。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)測定，CVF(%)=膠原面積/視野總面積×100%。

2.3免疫組化觀察心臟組織中巨噬細(xì)胞極化及炎癥因子和抗炎因子水平 將切片脫蠟后浸入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后，重復(fù)1次，冷卻后，PBS洗2次，每次5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，并滴加山羊血清室溫封閉20 min。分別加入抗CD11c(1 ∶50)、CD206(1 ∶100)、IL-6(1 ∶100)、TNF-α(1 ∶100)和IL-10(1 ∶50)抗體，4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗，37 ℃繼續(xù)孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色。最后用蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。IL-6、TNF-α和IL-10染色切片于100倍鏡下選取6個不同觀察區(qū)域，并進(jìn)行400倍鏡下拍片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集6個視野全部圖像的積分吸光度(integrated absorbance，IA)和陽性表達(dá)面積(stained area,SA)，并計算每張圖像的平均吸光度(mean absorbance,MA)，使用6張圖像的平均吸光度再計算平均數(shù)，得出每例樣本的平均吸光度，再進(jìn)行分析，按同樣的方式測算CD11c和CD206陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4Western blot測定蛋白水平 取各組小鼠心臟凍存組織樣本，37 ℃水浴解凍后按質(zhì)量體積比1 ∶10加入RIPA 裂解液，快速剪碎組織，置碎冰上裂解10 min，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度。根據(jù)所需樣本體積，按4:1比例加入5×Loding Buffer，混勻后熱循環(huán)儀95 ℃、 15 min使蛋白變性。配制8%、10%分離膠和5%濃縮膠，按蛋白量60 μg上樣，進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，經(jīng)5% BSA液封閉2 h后，加入抗p-MYPT1 Thr853(1∶500)、iNOS(1 ∶200)、Arg-1(1 ∶300)及β-actin (1 ∶5 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST(pH 7.4)洗膜3次，每次5 min，將膜放入相應(yīng) II 抗(1 ∶5 000)中，室溫孵育2～3 h，TBST洗膜3次,每次10 min，ECL發(fā)光液顯色，采用ChemiDoc XRS凝膠掃描成像儀及Image Lab凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗，方差齊則組間采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠體重及血糖的變化

與NS組相比，D+NS組小鼠成模后出現(xiàn)體重明顯下降，血糖水平亦明顯升高(P<0.05)。N+HF組較NS組體重與血糖值的差異并無統(tǒng)計學(xué)顯著性。同樣，各治療組體重與血糖值較D+NS組相比差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性，說明法舒地爾對小鼠體重及血糖無明顯影響，見圖1。

Figure 1.The body weight and blood glucose of the mice in each group were detected. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNS group.

圖1 各組小鼠體重及血糖的變化

2 小鼠心臟組織HE染色

HE染色觀察可見NS組和N+HF組心肌細(xì)胞排列整齊，輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)著色均勻；D+NS組心肌細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)著色不均，中膜層心肌纖維呈波浪樣變性，部分?jǐn)嗔眩桓髦委熃M較D+NS組心肌細(xì)胞排列較整齊，輪廓大致清晰，細(xì)胞質(zhì)著色較均勻，中膜層心肌纖維波浪樣變性及斷裂改變明顯減輕，見圖2。

Figure 2.The representative images of cardiac tissues in each group under light microscope (HE staining, ×400).

圖2 各組小鼠心臟組織HE染色結(jié)果

3 小鼠心臟組織Masson染色及CVF的變化

Masson染色時膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞胞漿呈紅色。NS組和N+HF組心肌間質(zhì)可見少許膠原纖維分布，CVF的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與NS組相比，D+NS組心肌間質(zhì)膠原纖維分布明顯增加，CVF顯著增大(P<0.05)；與D+NS組相比，各治療組心肌間質(zhì)膠原纖維分布明顯較少，CVF下降(P<0.05)；與D+LHF組相比，D+MHF組和D+HHF組CVF進(jìn)一步下降(P<0.05)，提示DCM存在明顯心肌纖維化，法舒地爾能劑量依賴性地減輕DCM心肌纖維化，見圖3。

Figure 3.Masson staining showed the changes of CVF of cardiac tissues in each group (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsD+NS group；$P<0.05vsD+LHF group.

圖3 Masson染色觀察各組小鼠心臟組織的CVF變化

4 免疫組化觀察小鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞極化及炎癥因子和抗炎因子的水平

CD11c識別M1型巨噬細(xì)胞，CD206識別M2型巨噬細(xì)胞。NS組和N+HF組中M1和M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-6、TNF-α和IL-10的蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與NS組相比，D+NS組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，IL-6和TNF-α的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，IL-10的蛋白水平顯著下降(P<0.05)；與D+NS組相比，各治療組的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-6和TNF-α的蛋白水平均呈劑量依賴性減少(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-10的蛋白水平隨著劑量增大而增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Immunohistochemical identification of macrophage phenotype marker proteins and the protein expression of IL-6, TNF-α and IL-10 in different groups (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsD+NS group;$P<0.05vsD+LHF group;&P<0.05vsD+MHF group.

圖4 各組小鼠心臟組織巨噬細(xì)胞極化及炎癥因子和抗炎因子蛋白水平的變化

5 小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平

NS組和N+HF組p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與NS組相比，D+NS組p-MYPT1 Thr853和iNOS的蛋白水平升高，Arg-1的蛋白水平降低(P<0.05)；與D+NS組相比，D+LHF組p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與D+NS組相比，D+MHF組和D+HHF組p-MYPT1 Thr853和iNOS的蛋白水平下降(P<0.05)，Arg-1的蛋白水平升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein levels of p-MYPT1 Thr853, iNOS and Arg-1 in different groups were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsD+NS group;$P<0.05vsD+LHF group.

圖5 各組小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853、iNOS和Arg-1的蛋白水平變化

6 相關(guān)性分析

通過兩變量間相關(guān)性分析(Pearson相關(guān)分析)發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853的蛋白水平與iNOS的蛋白水平明顯呈正相關(guān)(r=0.914，P<0.01)，與Arg-1的蛋白水平明顯呈負(fù)相關(guān)(r=-0.887，P<0.01)，見圖6。

Figure 6.Correlations between p-MYPT1 Thr853 and iNOS or Arg-1 expression.

圖6 各組小鼠心臟組織中p-MYPT1 Thr853的蛋白水平分別與iNOS和Arg-1蛋白水平的相關(guān)性

討 論

在病理狀況下，單核細(xì)胞由循環(huán)系統(tǒng)遷移并滲出到組織中分化形成巨噬細(xì)胞。未分化M0型巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下可誘導(dǎo)分化成不同類型。M1型巨噬細(xì)胞主要受脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)及干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)誘導(dǎo)，此外促炎因子TNF-α和IL-12等也能產(chǎn)生誘導(dǎo)作用?；罨腗1型巨噬細(xì)胞分泌大量的活性氮，加強(qiáng)Th1細(xì)胞免疫，隨著大量炎癥介質(zhì)的釋放產(chǎn)生強(qiáng)大的抗菌及細(xì)胞毒性作用，具有抗感染及抗腫瘤效應(yīng)，在急性損傷炎癥初期，首先滲出起到清除壞死組織的作用[15]。M2型巨噬細(xì)胞受誘導(dǎo)因子不同可分化為M2a、M2b和M2c 3種不同功能的亞型，M2a型由IL-4和IL-13誘導(dǎo)，M2b型由免疫復(fù)合物和IL-1誘導(dǎo)，IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)形成M2c型。M2a型能抑制INF-γ、IL-1和IL-6等炎癥介質(zhì)的釋放，同時能促進(jìn)TGF-β表達(dá)及細(xì)胞間基質(zhì)的沉積，但其吞噬功能較差，因具有修復(fù)組織的功能而又被稱為“組織修復(fù)型巨噬細(xì)胞”；M2b和M2c型通過介導(dǎo)慢性炎癥限制M1型巨噬細(xì)胞的異常持續(xù)活化造成的組織破壞，并未直接參與組織修復(fù)，而被稱為“調(diào)節(jié)型巨噬細(xì)胞”[16]。在炎癥的不同階段M1和M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮不同的作用，M1/M2型巨噬細(xì)胞比例的動態(tài)變化決定了炎癥的進(jìn)展及嚴(yán)重程度。Urbina等[5]發(fā)現(xiàn)在糖耐量減低小鼠模型的心臟組織中M2型巨噬細(xì)胞與正常組相比差異并無統(tǒng)計學(xué)顯著性，但經(jīng)骨形成蛋白7(bone morphorgenic protein-7, BMP-7)干預(yù)的模型小鼠M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯升高，同時伴有促炎因子TNF-α和IL-6降低及抗炎因子IL-1RA和IL-10的升高，干預(yù)組心肌纖維化及心臟功能明顯改善。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，DCM心臟組織中巨噬細(xì)胞以M1型為主，過度活化的M1型巨噬細(xì)胞加重心臟損傷，當(dāng)完全抑制小鼠中巨噬細(xì)胞的增殖及分化時，DCM病變并未有效減輕，但通過誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化，促炎因子明顯下降，抗炎因子升高，DCM的病變明顯減輕[4]。越來越多的證據(jù)表明，調(diào)控M1/M2型巨噬細(xì)胞的比例是DCM治療有效靶點[6-7]。本實驗中，我們選擇CD11c和iNOS作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，CD206和Arg-1作為M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，TNF-α和IL-6為觀察的促炎因子，IL-10為觀察的抗炎因子。與正常組相比，糖尿病組小鼠中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量及促炎因子的表達(dá)明顯增加，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而通過法舒地爾的干預(yù)M1型巨噬細(xì)胞極化明顯抑制，M2型噬細(xì)胞數(shù)量增加，炎癥水平明顯下降，DCM心肌纖維化有效改善，且隨著劑量增加抗纖維化作用越明顯，提示法舒地爾調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，恢復(fù)異常的M1/M2型巨噬細(xì)胞的比例，可能是其抗心肌纖維化的機(jī)制之一。

大量的研究表明，法舒地爾能有效改善DCM，目前認(rèn)為其可能與下列機(jī)制有關(guān)：(1)抑制纖維化關(guān)鍵信號通路JNK 和TGF-β/Smad的表達(dá)，減輕間質(zhì)纖維化[13]；(2)提高心肌細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)和單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)的活性，抑制脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的生成，提高抗氧化水平，并通過減少線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放數(shù)量，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)與功能[17]；(3)抑制心肌細(xì)胞Bax 表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞凋亡[12, 18]；(4)提高心肌細(xì)胞舒張期Ca2+回收相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)與活性，促進(jìn)舒張期胞質(zhì)Ca2+回收，并且修復(fù)受損的肌動蛋白與橫橋空間結(jié)構(gòu)，直接改善心肌的舒縮功能[19-20]。法舒地爾能特異性結(jié)合ROCK中ATP依賴的激酶結(jié)構(gòu)域并下調(diào)其活性，進(jìn)而抑制RhoA/ROCK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，MYPT1是ROCK下游結(jié)合底物之一，MYPT1的磷酸化程度能有效反映ROCK的活性[21]。本研究中，糖尿病組小鼠p-MYPT1 Thr853的蛋白水平增加，提示DCM中存在RCOK的激活，經(jīng)法舒地爾干預(yù)后，p-MYPT1 Thr853的蛋白水平下降，RCOK的活性受到抑制，同時我們發(fā)現(xiàn)MYPT1 Thr853磷酸化水平與iNOS的蛋白水平呈正相關(guān)，反之與Arg-1的蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，說明ROCK活性與巨噬細(xì)胞極化存在相關(guān)性。RhoA/ROCK信號通路過度激活是DCM發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制之一[22]。Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)下培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中RhoA/ROCK信號通路異常激活并調(diào)控巨噬細(xì)胞的黏附和分泌等多種生物學(xué)功能。由此我們推測，DCM發(fā)病中巨噬細(xì)胞的極化可能受RhoA/ROCK信號通路的調(diào)控，其機(jī)制有待進(jìn)一步體外研究。

綜上所述，法舒地爾可能通過抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，誘導(dǎo)M2型噬細(xì)胞極化，下調(diào)心臟炎癥水平，進(jìn)而減輕DCM心肌纖維化，有望成為DCM治療的一種新策略。同時，本實驗對DCM發(fā)病中RhoA/ROCK信號通路與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系做了初步探究，巨噬細(xì)胞極化是否受RhoA/ROCK信號通路調(diào)控有待進(jìn)一步研究。