曾先燕，張妞妞，吉曄楠，王文麗，賀忠梅

(山西醫(yī)科大學生理學系，細胞生理學教育部重點實驗室，山西 太原 030001)

缺血性心臟病(ischemic heart disease)是患病率與死亡率很高的一種疾病,心臟再灌注是目前主要的治療手段[1]。但在血流恢復過程中會使組織和器官的損傷加重，甚至危及生命，故將這種損傷稱為缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)[2]。I/RI有多種機制，比如大量自由基產(chǎn)生、早期炎癥細胞因子釋放、鈣超載以及線粒體功能障礙等，其中鈣超載是導致細胞不可逆損傷的重要因素[3]。越來越多的流行病學研究報告指出，富含草藥、水果和香料的飲食可以降低心血管疾病的風險[4]。橙皮素(hesperetin, HES)來源于蕓香科柑橘類植物果實，它的主要藥效成分是生物黃烷酮類，是橙皮苷的活性代謝產(chǎn)物，其生物學活性包括抗炎、抗腫瘤、抗過敏和抗氧化等[5]。近幾年研究表明，橙皮素對視網(wǎng)膜、腦及其它器官的缺血再灌注損傷有保護效應[6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素能減輕H2O2誘導的心肌 H9c2細胞氧化損傷[7]，而橙皮素預處理對低氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)誘導的心肌 H9c2細胞凋亡是否有影響尚不清楚。本文研究的主要目的是觀察橙皮素對H/R誘導細胞凋亡的作用并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

大鼠心肌H9c2細胞購自上海生命科學院。胎牛血清購自BI；高糖DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；100×青霉素-鏈霉素溶液和0.25%胰蛋白酶均購自武漢博士德生物工程有限公司；橙皮素和尼莫地平(nimodipine, Nim)均購自Sigma；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Ca2+GPCR分析-鈣離子指示探針和JC-1試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Ca2+-ATP酶ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF、凝膠配制試劑盒和超敏ECL化學發(fā)光試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；線粒體分離試劑、ATP檢測試劑盒和RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.45 μm PVDF膜購自Millipore；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的羊兔IgG和抗β-actin抗體均購自北京中杉金橋生物有限公司；抗電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)抗體購自CST；抗Bcl-2、Bax和細胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)抗體均購自Abcam。

2 主要方法

2.1采用CCK-8法與乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒分別檢測細胞的活力與壞死情況 細胞密度大約為5.0×106/L接種于96孔板，低氧12 h，復氧0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h，每組設6個平行孔，根據(jù)CCK-8試劑盒測定的細胞存活率，選擇最佳的低氧/復氧時點；在低氧/復氧時點進行不同濃度(6、12、25、50和100 μmol/L)的橙皮素預處理4 h；同理根據(jù)CCK-8法和LDH測定的細胞活力和壞死情況，確定橙皮素最佳濃度。

2.2實驗分組 細胞實驗分為常氧對照(control)組、H/R組、HES+H/R組、Nim+H/R組和HES組。在6孔板里培養(yǎng)心肌H9c2細胞，待細胞長至80%左右時進行實驗處理，橙皮素組培養(yǎng)液中含橙皮素濃度25 μmol/L，預處理4 h；10 μmol/L尼莫地平預處理1 h；正常對照組置于37 ℃、5% CO2的孵箱培養(yǎng)15 h；低氧/復氧組換成低糖培養(yǎng)基后置于37 ℃、1% O2、99% N2的低氧孵箱培養(yǎng)12 h，再次換液成10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)，復氧置于37 ℃、5% CO2、95%空氣的孵箱培養(yǎng)3 h。

2.3Caspase-3活性與ATP水平的檢測 正常狀態(tài)下caspase-3沒有活性，在胞漿中以酶原形式存在，而在細胞凋亡時caspase-3被激活；活化狀態(tài)的caspase-3由2個大亞基及2個小亞基組成，引起胞核底物降解，最終導致細胞凋亡。將樣本從-80 ℃取出，按照說明書比例加入裂解液，冰上裂解30 min，在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液到新的EP管，按照試劑盒說明書步驟，通過A誘導劑/A陰性對照的倍數(shù)來確定caspase-3活化的程度；細胞處理好后，根據(jù)試劑盒說明書進行操作裂解并離心，取上清液，通過酶標儀檢測吸光度(A)值，BCA法測定各組蛋白濃度，進而檢測細胞內(nèi)各組ATP水平。

2.4線粒體與胞漿蛋白的分離 細胞造模完成，收集細胞，使用線粒體分離試劑盒說明書進行操作，加入100 μL線粒體分離試劑4 ℃ 離心15 s再加入預冷線粒體分離試劑冰上玻璃勻漿器均勻化30次。勻漿完后在4 ℃、600 ×g離心10 min，去除細胞核和未破裂的細胞。然后上清液收集并離心4 ℃、12 000 ×g離心10 min，獲得胞漿(上清液)和線粒體(沉積)部分。得到的線粒體溶解在裂解緩沖液中儲存。

2.5ELISA測心肌 H9c2細胞Ca2+-ATP酶含量 細胞收集后用PBS稀釋細胞懸液，通過反復凍融，3 000 r/min離心20 min并收集上清，按照說明書進行操作，用酶標儀在450 nm波長下測出心肌 H9c2細胞Ca2+-ATP酶含量。

2.6Fluo-3AM染色 細胞接種于6孔板里，細胞模型建立完成后按照Ca2+GPCR分析-鈣離子指示探針試劑盒說明書操作，配制Fluo-3AM稀釋液濃度為10 μmol/L，每孔加入1 mL染液，在37 ℃避光孵育40 min，之后去掉染液，PBS漂洗2次，采用熒光顯微鏡進行熒光圖像采集。

2.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、鈣離子的熒光強度及線粒體膜電位 細胞處理后去掉培養(yǎng)液，加入不含EDTA胰蛋白酶消化細胞，800 r/min離心5 min并收集細胞，PBS洗3次，加入200 μL Binding Buf-fer，之后再加入5 μL AnnexinV-FITC與5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻，室溫避光20 min，混勻后使用流式細胞術(shù)進行檢測；在細胞處理后去掉培養(yǎng)液，采用Fluo-3AM進行染色，在37 ℃下避光孵育40 min，再加入不含EDTA胰蛋白酶消化細胞，轉(zhuǎn)速800 r/min離心5 min收集細胞，使用流式細胞術(shù)檢測Ca2+的熒光強度值；細胞處理后收集細胞，按試劑盒說明書配比例加入JC-1試劑混合液400 μL 37 ℃烘箱避光30 min，1 000 r/min離心5 min去掉上清加入200 μL buffer重懸細胞,上機進行檢測。

2.8Western blot分析 從-80 ℃取出樣本，加入RIPA裂解液(含PMSF)提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取等質(zhì)量蛋白進行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ 抗4 ℃過夜孵育(Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Cyt-C 1∶200、β-actin 1∶2 000、VDAC 1∶1 000稀釋)，Ⅱ 抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，洗脫后用超敏ECL發(fā)光液顯色，使用UVP凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，ImageJ軟件分析條帶的灰度值，則目的蛋白灰度值與內(nèi)參照蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件進行作圖。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。多組資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較多采用SKN-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 心肌 H9c2細胞低氧/復氧模型的建立與橙皮素最佳濃度確定

與control組相比，低氧12 h/復氧3 h細胞相對活力下降到50%左右(P<0.05)，見圖1A。給予不同濃度橙皮素0、6、12、25、50和100 μmol/L預處理心肌H9c2細胞，與0 μmol/L相比，25 μmol/L的HES可使H/R后的細胞活力顯著升高，LDH釋放顯著降低(P<0.05)，見圖1B、C。因此，以低氧12 h/復氧3 h和橙皮素濃度25 μmol/L作為最佳條件進行后續(xù)實驗。

Figure 1.Optimal time point and HES concentration for H/R in the H9c2 cells. A: the viability of H9c2 cells was measured by CCK-8 assay at different reoxgenation time points; B and C: the effects of pretreatment with different doses of HES on H/R-induced cell viability (detected by CCK-8 assay) and cell death (detected by extracellular LDH assay). Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0 h;△P<0.05vs0 μmol/L.

圖1 低氧復氧最佳時點與橙皮素最佳濃度的確定

2 橙皮素減輕H/R誘導心肌 H9c2細胞凋亡

Hoechst 33258染色與流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組明亮的藍色細胞核明顯增加，無論早期細胞凋亡率還是晚期細胞凋亡率均明顯升高;而與H/R組比，HES+H/R組明亮藍色的細胞核減少，凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖2A、2B。此外，caspase-3活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組相比，H/R組的caspase-3活性明顯增加；給予橙皮素預處理后caspase-3活性顯著降低(P<0.05)，見圖2C。這些結(jié)果表明橙皮素可減少H/R后的心肌H9c2細胞凋亡。

Figure 2.The effects of HES on H/R-induced apoptosis of the H9c2 cells. A and B: the apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining (scale bar=100 μm) and flow cytometry; C: the caspase-3 activity was assayed. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖2 橙皮素對低氧/復氧誘導心肌 H9c2細胞凋亡的影響

3 橙皮素可抑制低H/R誘導的心肌 H9c2細胞鈣離子超載

采用細胞內(nèi)Ca2+GPCR分析-鈣離子指示探針檢測，F(xiàn)luo-3AM孵育后用熒光顯微鏡與流式細胞術(shù)觀察心肌細胞內(nèi)鈣離子熒光強度變化。結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組細胞內(nèi)鈣離子熒光強度顯著增強；相比H/R組，HES+H/R組細胞內(nèi)鈣離子強度降低，見圖3A。流式細胞術(shù)結(jié)果分析，與control組相比，H/R組鈣離子熒光強度值明顯增加(P<0.05), HES+H/R組細胞內(nèi)鈣離子熒光強度值較H/R組降低(P<0.05)，見圖3B。以上結(jié)果表明橙皮素通過降低鈣超載減少H/R后的心肌 H9c2細胞凋亡。

Figure 3.HES decreased H/R-induced calcium overload in the H9c2 cells. Intracellular Ca2+was measured by Fluo3-AM staining, and the fluorescence intensity was analyzed by fluorescence microscopy (A) and flow cytometry (B). The scale bar=100 μm. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖3 橙皮素降低低氧/復氧誘導心肌 H9c2細胞鈣離子超載

4 橙皮素提高H/R誘導的心肌 H9c2細胞Ca2+-ATP酶活性

胞質(zhì)內(nèi)鈣的排出是由細胞膜或者肌質(zhì)網(wǎng)及線粒體膜上Ca2+-ATP酶來完成，因此我們檢測Ca2+-ATP酶活性。ELISA結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組細胞膜Ca2+-ATP酶活性明顯降低(P<0.05)；與H/R組相比，給予橙皮素預處理后細胞膜Ca2+-ATP酶活性顯著得以恢復(P<0.05)，見圖4。

5 橙皮素能逆轉(zhuǎn)H/R誘導心肌 H9c2細胞線粒體功能障礙

我們通過測定線粒體膜電位及ATP含量以反映線粒體功能。JC-1染色后行流式細胞術(shù)檢測，正常細胞位于R2門框外，居R2門框內(nèi)的橙紅色細胞代表發(fā)生凋亡的細胞，細胞下移數(shù)量可反映線粒體膜電位下降水平。結(jié)果顯示與control組比，H/R組R2門框中橙紅色熒光細胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；與H/R組相比，HES+H/R組R2門框中橙紅色熒光細胞數(shù)減少(P<0.05)；給予鈣離子拮抗劑尼莫地平(Nim)后，R2門框中橙紅色熒光細胞數(shù)則較H/R組有所減少(P<0.05),見圖5A。ATP含量測定結(jié)果顯示：與control組相比，H/R組心肌 H9c2 細胞內(nèi)ATP水平明顯下降(P<0.05)；與H/R組比，HES+H/R組與Nim+H/R組則增加細胞內(nèi)的ATP水平(P<0.05)，見圖5B。以上結(jié)果表明橙皮素減輕H/R后的細胞凋亡，并與抑制鈣超載從而改善線粒體功能障礙有關(guān)。

Figure 4.HES elevated H/R-induced calcium-ATPase activity. The Ca2+-ATPase activity was analyzed by ELISA assay. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖4 橙皮素升高低氧/復氧誘導心肌 H9c2細胞Ca2+-ATP酶活性

Figure 5.HES and Nim improved H/R-induced mitochondria function. A: mitochondrial transmembrane potential was analyzed by flow cytometry; B: the level of ATP was measured by microplate reader. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖5 橙皮素與尼莫地平改善低氧/復氧誘導的線粒體功能

6 橙皮素能逆轉(zhuǎn)H/R誘導的心肌 H9c2細胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達增加

利用Western blot法檢測線粒體蛋白Bcl-2、Bax和Cyt-C的表達情況，結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組Bcl-2/Bax比值明顯下降，胞漿Cyt-C蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，HES+H/R組與Nim+H/R組均明顯上調(diào)Bcl-2/Bax比值，同時胞漿Cyt-C蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖6。該結(jié)果表明橙皮素與尼莫地平預處理能降低線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達。

Figure 6.HES and Nim inhibited the expression of mitochondrial apoptosis-related proteins. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖6 橙皮素和尼莫地平抑制線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達

討 論

細胞凋亡是缺血性心臟病重要的病理改變。心肌缺血再灌注損傷中心肌細胞凋亡與鈣超載密切相關(guān)，再灌注時，心肌細胞膜上Ca2+-ATP酶活性下降導致胞漿內(nèi)Ca2+明顯升高，引起鈣超載[8]。Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使，不僅可激活磷脂酶使細胞及細胞器的生物膜結(jié)構(gòu)破壞，而且能夠降解膜磷脂生成花生四烯酸和溶血卵磷脂，加重細胞功能紊亂，激活蛋白酶促進結(jié)構(gòu)蛋白的分解[9]。研究表明銀杏葉其成分為黃酮苷類，其作用是抑制慢鈣通道縮短APD50和APD90，縮短有效不應期，發(fā)揮抗心律失常的作用[10]。橙皮素其主要成分為黃烷酮類，本研究結(jié)果顯示橙皮素對H/R誘導細胞內(nèi)鈣離子超載有抑制作用，并增加心肌細胞膜Ca2+-ATP酶活性從而改善細胞凋亡。

線粒體是細胞的能量工廠，文獻報道心肌缺血再灌注會引起心肌細胞內(nèi)鈣超載，導致線粒體功能障礙，從而引起心肌細胞能量減少[9]。線粒體膜電位降低啟動細胞凋亡的級聯(lián)反應，是細胞凋亡的一個早期特征[11]。本實驗對線粒體膜電位及ATP進行檢測發(fā)現(xiàn)橙皮素逆轉(zhuǎn)H/R誘導線粒體膜電位下降并提升ATP，同時給予鈣離子拮抗劑尼莫地平同樣可逆轉(zhuǎn)H/R后的心肌細胞線粒體膜電位降低。以上結(jié)果說明橙皮素是通過降低鈣超載而改善線粒體功能的。有研究表明，橙皮素通過減輕JNK-Bax線粒體凋亡途徑，發(fā)揮對脂多糖誘導心肌H9c2 細胞的保護作用[12]。當細胞凋亡時，線粒體結(jié)構(gòu)會發(fā)生一些明顯變化，例如線粒體凋亡蛋白Cyt-C等釋放于胞漿內(nèi)，線粒體凋亡途徑中凋亡分子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Bcl-2家族包括許多抗凋亡蛋白(例如Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w)及某些促凋亡蛋白(例如Bax、Bak和Bid)被激活表達[13-14]，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮素上調(diào)Bcl-2/Bax比值及減少線粒體Cyt-C釋放到胞漿。

綜上所述，本實驗通過建立心肌 H9c2細胞低氧/復氧模型，觀察橙皮素對細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示橙皮素可明顯減少H/R后的心肌 H9c2 細胞凋亡率，同時對胞內(nèi)鈣離子超載有抑制作用，可改善線粒體功能及降低線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達；給予鈣離子拮抗劑尼莫地平，同樣減輕H/R誘導的線粒體功能障礙?？梢姵绕に販p少H/R誘導的心肌 H9c2細胞凋亡與降低鈣離子超載從而改善線粒體功能有關(guān)。本研究為冠心病術(shù)后并發(fā)癥治療提供新的方向。由于Ca2+調(diào)控是一個復雜的過程，完全闡釋橙皮素對Ca2+超載的作用，還需進一步探究其具體的通路和上下游關(guān)系。