郝繼偉，李鶯歌，王 來(lái)，耿慧霞△

(河南大學(xué)1護(hù)理與健康學(xué)院，2生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475001)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種中樞神經(jīng)慢性退行性疾病，其典型的神經(jīng)病理學(xué)變化為大腦內(nèi)出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉淀形成老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)，從而致使神經(jīng)元大量凋亡，導(dǎo)致患者記憶能力的降低和認(rèn)知、情感的障礙[1]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦神經(jīng)元內(nèi)轉(zhuǎn)入突變的淀粉樣前體蛋白(APPswe)和早老素(ΔE9)基因，從而使該小鼠的大腦內(nèi)在3月齡時(shí)即可檢測(cè)出Aβ斑，因此，常作為研究AD的一種動(dòng)物模型[2]。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，廣泛表達(dá)在皮層、海馬、杏仁核和小腦等腦區(qū)，參與神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)、軸突出芽和樹突棘形成等神經(jīng)元的成熟過(guò)程，影響著神經(jīng)元與神經(jīng)元之間突觸的可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力的形成等高級(jí)神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程[3]。AD患者的臨床檢測(cè)顯示大腦內(nèi)BDNF的表達(dá)減少，然而對(duì)多種AD動(dòng)物模型的研究表明，腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平的變化出現(xiàn)差異，如APPswe和APPswe/PS1-P264L模型小鼠的BDNF在mRNA水平降低，而APPswe/PS1-M146V 模型小鼠沒(méi)有發(fā)生該類改變；APPswe/PS1/tau模型小鼠腦內(nèi)BDNF在蛋白質(zhì)水平表達(dá)降低，而另外的研究顯示該蛋白的表達(dá)水平升高[4]。為進(jìn)一步明確AD動(dòng)物模型APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)變化以及對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響，本研究以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象，利用剛果紅染色、TUNEL試劑盒、免疫熒光、Western blot技術(shù)和Morris水迷宮方法分別檢測(cè)大腦皮層和海馬區(qū)淀粉樣蛋白Aβ斑的沉積，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，BDNF的表達(dá)以及空間學(xué)習(xí)記憶能力，從而深入探究BDNF在野生型小鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬內(nèi)的表達(dá)變化以及對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2001-0001]，并在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁育。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄鼠與野生型雌鼠合籠繁殖，幼鼠2周后，做基因型鑒定，選取6月齡和12月齡的雌雄APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠和野生型小鼠作為研究對(duì)象。在保證供水、飼料充足的前提下，按自然晝夜節(jié)律，室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度60%～80%的環(huán)境下飼養(yǎng)。

2 主要試劑

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega；DAPI試劑和剛果紅染色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；兔抗BDNF多克隆抗體(ab108319)和鼠抗β-actin多克隆抗體(ab8226)購(gòu)自Abcam；2×PCR Mix和RIPA裂解液購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限公司；增強(qiáng)型ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore；Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光 II 抗和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher；HRP標(biāo)記的 II 抗購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1石蠟切片 選取適宜月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因和C57BL/6野生型小鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，預(yù)冷PBS經(jīng)心臟灌流，直至灌流液清亮為止，隨后用4%的多聚甲醛緩緩進(jìn)行灌注固定。將固定后的小鼠用剪刀從頸部剪開取出完整大腦，并置于4%多聚甲醛中室溫浸泡固定24 h，然后用PBS漂洗3次。對(duì)固定后的大腦組織塊進(jìn)行修剪處理，棄小腦，分離左右半球。隨后進(jìn)行脫水處理，依次在濃度為50%的乙醇浸泡2 h、70%的乙醇浸泡過(guò)夜、80%的乙醇浸泡1 h、90%的乙醇浸泡1 h、95%的乙醇Ⅰ浸泡1 h、95%的乙醇Ⅱ浸泡1 h、無(wú)水乙醇Ⅰ浸泡1 h、無(wú)水乙醇Ⅱ浸泡1 h、二甲苯Ⅰ浸泡1 h、二甲苯Ⅱ浸泡1 h，放入冬青油中過(guò)夜。提前1～2 h打開生物組織包埋機(jī)，脫水后的組織塊分別用蠟Ⅰ、蠟Ⅱ和蠟Ⅲ各處理1 h，最后用硬蠟包埋即可得到蠟塊。將蠟塊置于萊卡輪式切片機(jī)(Leica，RM2235)上切為厚度為4 μm的薄片。

3.2Aβ斑標(biāo)記 將切好的組織切片鋪于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60 ℃烘箱烘干1 h，常規(guī)脫蠟至水(二甲苯Ⅰ浸泡15 min，二甲苯Ⅱ浸泡15 min、無(wú)水乙醇Ⅰ浸泡5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ浸泡5 min、95%的乙醇Ⅰ浸泡5 min、95%的乙醇Ⅱ浸泡5 min、90%的乙醇浸泡5 min、80%的乙醇浸泡5 min、70%的乙醇浸泡5 min、50%的乙醇浸泡5 min)。入蘇木素染色液浸染5～15 min，酸性乙醇分化10～15 s，然后立即入水終止分化，自來(lái)水沖洗2 min，再用堿性NaCl溶液浸染切片，然后將切片直接放入堿性剛果紅染色液浸染(溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用)，無(wú)水乙醇沖洗，逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡(Olympus, BX61)觀察海馬和皮層區(qū)域并拍照。

3.3TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取小鼠大腦石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。將載玻片依次浸入0.85% 的NaCl溶液5 min、PBS 5 min、4%的甲醛溶液20 min,PBS洗滌 5 min×3次，蛋白酶 K覆蓋孵育7～12 min、PBS 5 min、4%的甲醛溶液5 min、PBS 5 min、100 μL平衡緩沖液覆蓋細(xì)胞5～10 min(以上過(guò)程均在室溫下進(jìn)行)。與此同時(shí)提前避光配制rTdT孵育緩沖液(每50 μL 反應(yīng)體系含有平衡緩沖液45 μL+核苷混合物5 μL+rTdT酶1 μL)。吸去平衡緩沖液，然后在細(xì)胞上加上rTdT孵育緩沖液，置于濕盒內(nèi)，在37 ℃孵育60 min發(fā)生加尾反應(yīng)，避免光照，后將載玻片浸入2×SSC溶液，室溫放置15 min以終止反應(yīng)，后將載玻片浸入新鮮的PBS中洗滌3次，每次5 min。DAPI甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察皮層和海馬區(qū)域并拍照。

3.4免疫熒光 選取石蠟切片，脫蠟至水，0.1 mol/L的 PBS浸洗3次，每次10 min,后將石蠟切片浸入檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱到92～100 ℃ 10 min(注意不能沸騰)以修復(fù)抗原，待放置恢復(fù)常溫后PBS洗3次，每次10 min,擦干切片組織周圍水分后用免疫組化筆圈起組織，加稀釋過(guò)的 I 抗(兔抗BDNF多克隆抗體，稀釋比例1∶100)，放置于濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱過(guò)夜。次日早晨，取出室溫放置30 min，PBS洗滌3次,每次10 min。擦干多余液體，注意組織不能干透，避光加稀釋過(guò)的 II 抗(稀釋比例1∶500)，室溫孵育3 h或38 ℃ 30 min，PBS洗滌3次，每次10 min,DAPI甘油封片，熒光顯微鏡(Olympus，BX61)觀察皮層和海馬區(qū)域并拍照。

3.5Western blot實(shí)驗(yàn) 10%水合氯醛腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，冰上灌流，取腦，剝離皮層和海馬，分別置于800 mL和500 mL 的RIPA裂解液中，勻漿器勻漿，4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清凍存-80 ℃?zhèn)溆谩CA法對(duì)蛋白定量。30 μg樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離，電流200 mA，濕法轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入 I 抗，4 ℃過(guò)夜。次日早上，用TBST漂洗3次，每次5 min,然后在含有 II 抗的孵育袋內(nèi)室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，每次5 min,添加ECL發(fā)光液暗室曝片。

3.6Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 分2個(gè)部分進(jìn)行。第1部分為定位航行實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)用于訓(xùn)練和檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。每天訓(xùn)練小鼠，選定水迷宮的某一象限將小鼠放入，攝像頭記錄并計(jì)算小鼠從放入點(diǎn)游到平臺(tái)所需的時(shí)間，即為逃避潛伏期；倘若小鼠在60 s時(shí)間內(nèi)沒(méi)有游行到平臺(tái)，則引導(dǎo)其到平臺(tái)并停留10 s。每天如此訓(xùn)練，共持續(xù)6 d。第7天開始記錄小鼠游到平臺(tái)所需的時(shí)間即為逃避潛伏期。第2部分為空間搜索實(shí)驗(yàn)：在第8天時(shí)，將水下平臺(tái)撤除，將小鼠放置在訓(xùn)練時(shí)的同一象限，記錄60 s內(nèi)小鼠尋找平臺(tái)所耗費(fèi)的時(shí)間和進(jìn)入該平臺(tái)所位象限的次數(shù)，作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Aβ斑的形成

剛果紅染色標(biāo)記皮層和海馬區(qū)Aβ斑變化的結(jié)果顯示，12月齡的野生型小鼠皮層和海馬CA1區(qū)都沒(méi)有見(jiàn)到Aβ斑的出現(xiàn)，而6月齡和12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬CA1區(qū)都出現(xiàn)Aβ斑，且12月齡小鼠Aβ斑的數(shù)量多于6月齡小鼠(P<0.05)。對(duì)Aβ斑的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小分析表明，12月齡小鼠皮層和海馬CA1區(qū)Aβ斑的形態(tài)明顯大于6月齡小鼠,見(jiàn)圖1、2。這說(shuō)明隨著年歲的增加和發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，腦內(nèi)形成的Aβ斑數(shù)量增加，形態(tài)變大，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)就采用12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象。

2 神經(jīng)元凋亡

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果顯示，12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于野生型小鼠(P<0.01)，見(jiàn)圖3、4。

3 BDNF的表達(dá)

分別采用免疫熒光和Western blot的方法檢測(cè)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠皮層和海馬區(qū)BDNF的表達(dá)變化。免疫熒光的結(jié)果顯示，野生型小鼠BDNF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量多于APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(P<0.01),見(jiàn)圖5。Western blot結(jié)果顯示，野生型小鼠皮層和海馬區(qū)成熟形式的BDNF表達(dá)量明顯高于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(P<0.01),見(jiàn)圖6。

Figure 1.Aβ plaques were stained with Congo red in the cerebral cortex of WT andAPP/PS1transgenic mice. A: WT mice; B: 6-month-oldAPP/PS1mice; C: 12-month-oldAPP/PS1mice; D: the quantificative analysis of Aβ plaques inAPP/PS1mice. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs6 months.

圖1 剛果紅染色標(biāo)記皮層的Aβ斑

Figure 2.Aβ plaques were stained with Congo red in the hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice. A: WT mice; B: 6-month-oldAPP/PS1mice; C: 12-month-oldAPP/PS1mice; D: the quantitative analysis of Aβ plaques inAPP/PS1mice. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs6 months.

圖2 剛果紅染色標(biāo)記海馬的Aβ斑

4 空間學(xué)習(xí)記憶能力

Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的逃逸潛伏期長(zhǎng)于野生型小鼠，且在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)也少于野生型小鼠(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖7A、B。軌跡圖的結(jié)果表明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)行軌跡雜亂無(wú)章，而野生型小鼠運(yùn)行軌跡并不雜亂，圍繞平臺(tái)尋找，規(guī)律性比較明顯,見(jiàn)圖7C。

討 論

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，AD嚴(yán)重威脅著中老年人的身心健康。病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該病的典型病理學(xué)特點(diǎn)為大腦內(nèi)出現(xiàn)Aβ斑聚集和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，并觀察到神經(jīng)元的凋亡和軸突降解，致使患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、記憶能力降低等癥狀。有研究顯示，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為AD研究的動(dòng)物模型，最早在3月齡時(shí)即可觀測(cè)到腦內(nèi)Aβ斑的形成，本研究證實(shí)，該鼠在6個(gè)月時(shí)可觀察到皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)Aβ斑，并隨病程的增長(zhǎng)，12月齡時(shí)，Aβ斑的數(shù)量和形態(tài)都呈進(jìn)行性增加，說(shuō)明隨著年歲的增加，該小鼠AD的神經(jīng)病理學(xué)變化更加明顯，符合臨床上年齡越大該病發(fā)病率越高、癥狀越嚴(yán)重的特點(diǎn)。伴隨Aβ斑形成，出現(xiàn)的是神經(jīng)元凋亡的數(shù)量發(fā)生相應(yīng)的變化，如12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)量與野生型相比急劇增加。對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)也表明，12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力受到嚴(yán)重?fù)p傷，如逃逸潛伏期所耗時(shí)長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生型小鼠，在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)所位象限的次數(shù)也少于野生型小鼠，且在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的游泳軌跡雜亂無(wú)章，沒(méi)有規(guī)律可循。這些變化與AD患者出現(xiàn)Aβ斑聚集的病理變化和病程增加出現(xiàn)認(rèn)知、記憶功能障礙的臨床表現(xiàn)相一致，表明該轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為研究AD發(fā)病機(jī)制的一種理想動(dòng)物模型。

Figure 3.Apoptosis in the cerebral cortex of WT andAPP/PS1transgenic mice was detected by TUNEL assay. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖3 野生型和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層細(xì)胞凋亡情況的比較

Figure 4.Apoptosis in the hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice was detected by TUNEL assay. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖4 野生型和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況的比較

Figure 5.BDNF positive cells were detected by immunofluorescence staining in cerebral cortex and hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖5 免疫熒光檢測(cè)皮層和海馬區(qū)BDNF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)

Figure 6.BDNF expression was detected by Western blot in the cerebral cortex and hippocampus of WT andAPP/PS1transgenic mice. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖6 Western blot檢測(cè)皮層和海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

Figure 7.The changes of learning and memory abilities of WT andAPP/PS1transgenic mice. A: the escape latency; B: the times across the platform quadrant in 60 s; C: the swim-tracking path. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖7 野生型與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化

BDNF最早由德國(guó)神經(jīng)化學(xué)家Barde從豬的大腦中分離并克隆[5],其基因在人類定位于第11號(hào)染色體短臂1 區(qū)3 帶(11p13)，而在鼠類定位于第12號(hào)染色體上。BDNF基因編碼的多肽鏈為前體BDNF(proBDNF)，相對(duì)分子質(zhì)量約為32 kD，經(jīng)過(guò)胞內(nèi)的絲氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶切除N端的信號(hào)肽等翻譯后修飾過(guò)程，從而形成相對(duì)分子量為13 kD的具有生物學(xué)活性的成熟形式BDNF(active BDNF)[6-7]。成熟形式的BDNF與酪氨酸蛋白激酶受體TrkB結(jié)合發(fā)揮其促進(jìn)神經(jīng)元分化、發(fā)育、存活、軸突出芽、樹突棘形成、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶的形成和維持等神經(jīng)生物學(xué)功能[8]。本研究證實(shí)，BDNF陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量在12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬區(qū)與野生型相比明顯減少，并且成熟形式的BDNF表達(dá)也隨著減少，表明BDNF在大腦的表達(dá)量降低參與了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生AD的病理變化及臨床表現(xiàn)，如神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加和學(xué)習(xí)記憶能力降低。

BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要作用促使研究人員關(guān)注其參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理機(jī)制和治療潛力，對(duì)AD患者的大腦標(biāo)本檢測(cè)表明，BDNF在mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平都出現(xiàn)降低，且這種減低在AD患者出現(xiàn)輕度認(rèn)知障礙階段就已發(fā)生，說(shuō)明BDNF在大腦內(nèi)表達(dá)水平的降低確實(shí)導(dǎo)致AD記憶能力降低等臨床癥狀的出現(xiàn)[4]。BDNF基因的單核苷酸多態(tài)性(Val66Met，rs6265)影響該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和分泌，也參與AD的發(fā)病病理機(jī)制，尤其是Met攜帶者具有更嚴(yán)重的Aβ斑聚集和認(rèn)知功能障礙[9-10]。其它研究證明，增強(qiáng)或促進(jìn)腦內(nèi)BDNF的表達(dá)可以改善其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理改變和臨床癥狀，如腦內(nèi)高的BDNF水平抑制抑郁癥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，減輕抑郁癥癥狀，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-12]。本研究顯示，12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬區(qū)成熟形式BDNF的表達(dá)下降，并出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡增加，導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的降低。因此，調(diào)控腦內(nèi)成熟BDNF的含量也許可以作為預(yù)防和治療AD的一個(gè)有效手段。