李光明，管雪琴, 劉思思，梁敏杰，潘 銳, 唐海杰, 顏學勤，王會麗，顏 亮，付詠梅，周 全，董 軍△

(1暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理學實驗室，粵港澳中樞神經再生研究院，2暨南大學附屬第一醫(yī)院骨科，3暨南大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學影像中心，廣東 廣州 510632；4南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510630)

神經退行性疾病包括阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)、亨廷頓(Huntington disease，HD) 和HIV 相關神經認知障礙(HIV-associated neurocognitive disorders，HAND)等[1]，表現為蛋白質在大腦中錯誤折疊、聚集和積累導致神經毒性，可影響抽象思維、熟練動作、情緒感受、 認知和記憶等能力[2]，從而出現認知功能障礙。然而，目前臨床上治療神經認知障礙的藥主要是緩解癥狀，并沒有改變神經元的丟失和退化。中藥川芎嗪是從川芎塊莖提取的酰胺類生物堿，主要成分是四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)[3]。研究表明，川芎嗪可擴張腦血管，降低血管阻力，顯著增加腦及肢體血流量，改善微循環(huán)；能降低血小板表面活性、抑制血小板凝聚、預防血栓的形成；抗炎、抗氧化、保護神經等作用[4]。但川芎嗪對神經認知障礙的研究尚未見報道。

我國老齡化進程加劇，對神經認知障礙的認識和預防迫在眉睫。神經認知障礙是神經退行性疾病的主要表現之一，進一步惡化可能導致阿爾茨海默病[5]。 因此，早期發(fā)現及診斷神經認知障礙并對其進行干預對于延緩其向神經退行性疾病轉化具有現實意義。神經影像學檢查是癡呆及神經認知障礙診斷不可或缺的一部分，但是功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)還只限于臨床研究[6]。本研究應用體素內非相干運動(intra-voxel incoherent motion，IVIM)技術分辨神經影像學特征，特別是認知障礙早期的影像學及腦微觀結構的改變。IVIM是近年興起的一項 MRI 新技術，由Le Bihan等[7]在20世紀80年代提出，理論前提是在生物組織內，除考慮組織內水分子擴散外，微循環(huán)毛細血管灌注的影響也是不可或缺的[8]。IVIM成像可通過擴散系數(diffusion coefficient, D)和偽擴散系數(pseudodiffusion coefficient, D*)分別評價純水分子擴散運動成分和血流灌注相關的擴散運動，從而達到無創(chuàng)評價組織微觀結構及微循環(huán)灌注情況的目的[9]。

神經退行性疾病的發(fā)病機制與中樞神經系統(tǒng)損傷部位的潛在炎癥過程有關，稱為“神經炎癥”[10]。原發(fā)性神經元損傷可能通過釋放營養(yǎng)因子和炎癥介質引起局部神經炎癥[11]。腦立體定向注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是目前用來誘導腦內神經炎癥的模型[12]。脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一種組成成分，能誘導炎癥，對免疫細胞有不同的作用，可作為腦炎癥誘導劑[13]。本研究通過觀察川芎嗪對LPS所致大鼠神經認知障礙的影響，并測定腦純水分子擴散運動和血流灌注探討川芎嗪減輕LPS致神經認知障礙的作用及功能影像學分子機制，為防治神經退行性疾病提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物

采用SPF級健康雌雄各半SD大鼠36只，鼠齡4～8周，體重120～180 g，由濟南朋悅實驗動物中心提供(動物合格證編號3700920006246)。飼養(yǎng)于暨南大學實驗動物中心SPF環(huán)境，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，12 h晝/夜交替照明，自由進飲進食；在暨南大學實驗動物中心適應環(huán)境，過10 d隔離檢疫期后，開始實驗。本實驗完全按照暨南大學實驗動物倫理委員會的要求進行。

2 主要試劑及儀器

戊巴比妥鈉購自Sigma；LPS購自Sigma；鹽酸川芎嗪注射液購自成都倍特藥業(yè)有限公司(國藥準字號H32013383)；大鼠白細胞介素(interleukin, IL)-1β(SEA563Ra)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α(SEA133Ra)ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生有限公司。腦立體定位儀和顱骨鉆購自瑞沃德公司；3.0T核磁共振成像儀購自飛利浦公司。

3 主要方法

3.1構建LPS致神經認知障礙模型及分組 側腦室注射(intracerebroventricular injection，icv):首先用3%的戊巴比妥鈉對大鼠腹腔注射(1.5 mL/kg)進行麻醉，后將其固定于腦立體定位儀上，碘伏消毒頭頂部皮膚，頭頂正中由前向后作長約1 cm手術切口，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟后1.0 mm、矢狀縫(mediolateral，ML)左右1.8 mm為注射點，進針深度(dorsoventral，DV)3.8 mm。準確定位后，先用黑筆標記，然后用顱骨鉆打孔，見腦脊液溢出停止鉆孔，然后把制作好的套管，插入側腦室里，用牙科水門汀封膠固定。手術觀察3 d后，把用人工腦脊液 (artifical cerebrospinal fluid,ACSF)配制的LPS溶液 (1 g LPS溶入10 mL ACSF中，配成100 mg/L LPS母液；取15 μL LPS母液，加入35 μL ACSF配成150 μg/5 μL的LPS溶液)5 μL用微量進樣針沿套管插入緩慢注射，每注射2 μL停針2 min。注射完畢后，留針10 min，緩慢退針；消毒后，用牙科水門汀封膠。實驗動物編號，水迷宮訓練完成后，根據水迷宮逃避潛伏期，利用隨機數字表法，隨機分為6組，每組6只：(1)空白對照組(control group)：腹腔注射0.9%生理鹽水，每只10 mL/kg，注射5 d；(2)假手術組(sham group)：先行腹腔注射0.9%生理鹽水，每只10 mL/kg，注射5 d；icv法將ACSF注射入大鼠腦內，每只5 μL，注射1次；(3)模型組(model group, LPS group):先行腹腔注射0.9%生理鹽水，每只10 mL/kg，注射5 d;再icv法將150 μg, 5 μL LPS注射入大鼠腦內，每只5 μL，注射1次；(4)低劑量組(low dose group)：先行腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液每只50 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把50 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液配制成5 g/L)，注射5 d；再icv法將150 μg/5 μL LPS注射入大鼠腦內，每只5 μL，注射1次；(5)中劑量組(medium dose group)：先行腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液,每只100 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把100 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液配制成10 g/L)，注射5 d；再icv法將150 μg/5 μL LPS注射入大鼠腦內，每只5 μL，注射1次；(6)高劑量組(high dose group)：先行腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液每只200 mg/kg(按1 mL/100 g注射，需把200 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液配制成20 g/L)，注射5 d；再icv法將150 μg/5 μL LPS注射入大鼠腦內，每只5 μL，注射1次。術程順利，高劑量組死亡1只。側腦室注射后第9天，麻醉處死大鼠，取出全腦，備用。

3.2Morris水迷宮實驗并檢測大鼠空間學習及記憶能力 術后第2天，大鼠進行Morris水迷宮實驗。水深約26 cm，平臺隱藏于水下，水溫(24±1)℃。(1) 第1～6天的定位航行實驗檢測大鼠學習能力:水迷宮分為 4 個象限，隨機將大鼠從任一象限以臉部面向池壁放入水中，記錄大鼠找到隱藏平臺所需時間，作為潛伏期; 探尋總時長為90 s，若大鼠未能在規(guī)定時間內找到平臺，則引導其游上平臺并在平臺停留10 s，其潛伏期記為90 s。(2) 第7天的空間探索實驗檢測大鼠記憶能力: 實驗第7天撤去水下平臺，選取平臺所在象限的對角象限為大鼠入水點，記錄大鼠在 90 s 內穿過平臺區(qū)的次數及在平臺象限內停留的時間。

3.3ELISA檢測炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量 各組織大鼠4%多聚甲醛灌注完全后，各取3只冰上迅速斷頭取腦，分離皮層和海馬。低溫勻漿將大腦組織研磨制成勻漿液。4 ℃、12 000×g離心15 min,取上清，后續(xù)實驗按照IL-1β和TNF-α的ELISA說明書嚴格操作。

3.4MRI檢查 第7天水迷宮結束后，大鼠進行MRI掃描，先用3%戊巴比妥鈉麻醉，拆去套管，放到核磁共振成像機器掃描。除了普通序列外，主要掃描IVIM。所有納入的實驗對象均采用 GE 3.0T MR 掃描儀(GE Healthcare Discovery MR 750)完成 MRI 檢查，所有數據由腕關節(jié)線圈采集。行軸位 T2WI propeller 掃描及IVIM-DWI掃描，掃描參數：(1)T2WI propeller 序列：TR 4295 ms, TE 76 ms,視野(FOV)600 mm×600 mm，矩陣 256×256，層厚 2 mm，層間隙 0 mm，激勵次數 2 次; (2)軸位 IVIM-DWI 序列：使用單次激發(fā)自旋回波成像序列，TR 3500 ms，TE minimum ms，15個不同的 b 值(0、 20、 30、 50、 80、100、200、 400、 600、 800、 900、1 000 s/mm2)，FOV 600 mm×600 mm，矩陣 128×128，層厚2 mm，層間隙 0 mm，帶寬125 kHz。

3.5圖像后處理 IVIM-DWI圖像后處理：根據經典雙指數模型，應用 GE AW 4.5 后處理工作站內置軟件，分析圖像數據的信號衰減，計算D、D*及灌注分數(perfusion fraction, f)。結合 T2WI序列，分別在海馬的2個層面分別勾勒出左右的海馬輪廓，畫4個感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，并在同層面左右皮層各勾畫2個ROI(約2 mm×2 mm)，ROI 的放置應避開右側側腦室注射通道，每個 ROI重復勾畫3次后取平均值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準誤 (mean±SEM) 表示。組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時組間兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗；若方差不齊，則組間兩兩比較用 Tamhane’s T2 檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 川芎嗪對LPS致大鼠神經認知障礙的空間學習記憶能力的影響

Morris水迷宮定位航行實驗0 d(訓練結束后的逃避潛伏期)、1 d、3 d、5 d和6 d結果表明，與空白對照組和假手術組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；而川芎嗪低劑量治療組，大鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05),見圖1A。第 6天定位航行代表性路徑圖表明，與模型組相比，川芎嗪低劑量治療組大鼠導航策略變得更好,見圖1D。第7天的空間探索實驗結果顯示，相比假手術組，模型組穿梭平臺次數和目標象限停留時間均降低；相比模型組，川芎嗪低劑量組大鼠穿梭平臺次數增加，目標象限停留時間延長(P<0.05)，見圖1B、C。

2 川芎嗪對神經認知障礙大鼠體內炎癥因子IL-1β和TNF-α的影響

ELISA實驗結果表明，與假手術組相比，LPS處理組大鼠皮質和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α分別增加(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組大鼠大鼠皮質和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α分別降低(P<0.05)，中、高劑量組無顯著差異(P>0.05),見圖2。

3 川芎嗪改善LPS誘導的神經認知障礙的MRI功能影像學影響

MRI功能影像學掃描圖層及ROI測量范圍見圖3。與假手術組相比，模型組的皮層和海馬各組間的D、D*和f值均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，川芎嗪低劑量組的D、D*和f值均顯著升高(P<0.01),見表1。

討 論

神經認知障礙是神經退行性疾病主要的臨床表現癥狀，防治神經認知障礙將為神經退行性疾病的研究提供新的策略。隨著一些中藥新的藥理作用和分子機制被發(fā)現和揭示，中藥將為防治神經認知障礙的治療提供新方法[14]。本研究行為學檢測結果顯示，LPS誘導的川芎嗪低劑量組大鼠的學習記憶能力顯著改善。已有研究顯示川芎嗪可以降低腦缺血再灌注損傷的神經炎癥從而減輕腦損傷[15]。在本研究中，我們觀察到川芎嗪還可以減輕神經認知障礙程度。

根據現有研究猜測，川芎嗪減輕神經認知障礙的機制可能是川芎嗪可以抑制腦中神經炎癥反應，緩解神經細胞的水腫，增加腦中血流循環(huán)，從而緩解神經認知障礙。本研究檢測到模型組大鼠皮層和海馬的IL-1β和TNF-α均顯著增加，表示模型組發(fā)生了神經炎癥，這與 Wu等[16]用LPS誘導大鼠腦神經炎癥的結果相似；神經炎癥導致神經細胞凋亡、壞死，從而引起神經認知障礙。而用低劑量川芎嗪治療的大鼠，其皮層和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α均顯著降低，表明低劑量川芎嗪可以抑制腦中神經炎癥，從而減輕神經認知障礙。

Figure 1.Tetramethylpyrazine improved the spatial learning and memory abilities of SD rats with LPS-induced neurocognitive impairment. A: water maze escape latency; B and C: the times of each animal entering the small target zone and the time spent in the target quadrant; D: the representative swimming path at day 6 of training with space exploration. Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01vsmodel group.

圖1 川芎嗪對LPS所致神經認知障礙大鼠空間學習和記憶能力的影響

Figure 2.The effect of tetramethylprazine on the relative expression of inflammatory factors induced by LPS. A: the relative expression of IL-1β in the cortex and hippocampus detected by ELISA; B: the relative expression of TNF-α in the cortex and hippocampus measured by ELISA. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsmodel group.

圖2 川芎嗪對神經認知障礙相關炎癥因子相對表達的影響

Figure 3.Representative MRI functional imaging scan layer and measurement range. A： the scanned T2WI layer； B: 1 and 2 of regions represent the hippocampus, while 3 and 4 of regions represent the cortex; C: the merged A and B scan sequences.

圖3 MRI功能序列掃描層和ROI測量范圍

表1 各組大鼠皮層和海馬的D、D*和f值

Table 1.The values of diffusion coefficient (D), pseudodiffusion coefficient (D*), perfusion fraction (f) in the cortex and hippocampus of the rats in each group (mm2/s. Mean±SEM)

GroupnCortexHippocampusD (×10-4)D* (×10-3)fD (×10-4)D* (×10-3)fControl67.25±0.1145.80±3.110.28±0.027.73±0.2340.90±2.530.28±0.03Sham67.19±0.18**44.70±3.12**0.27±0.02**7.64±0.24**41.20±2.11**0.27±0.00**Model66.21±0.2020.60±2.240.18±0.026.78±0.1017.50±1.120.16±0.01Low dose69.46±0.49**39.90±3.56**0.28±0.00**8.79±0.52**39.80±1.63**0.25±0.01**Medium dose66.67±0.2121.60±3.010.20±0.017.04±0.1421.30±1.120.16±0.01High dose56.65±0.2819.30±3.960.21±0.006.76±0.2219.50±1.660.17±0.02

**P<0.01vsmodel group.

本研究應用fMRI檢查結果顯示,LPS誘導的神經炎癥分別導致大鼠腦皮層和海馬神經細胞實質水分子的彌散程度(D)、水分子之間的偽擴散系數(D*)和血管的灌注分數(f)分別顯著降低。分析原因發(fā)現神經細胞發(fā)生炎癥反應，引起細胞的毒性水腫、變性壞死，導致水分子彌散受限；而白細胞聚集，導致微循環(huán)淤滯，腦血流量灌注水平降低，引起大腦學習記憶能力降低。這與van Bussel等[8]觀察到微血管壁組織彌散能力降低會影響糖尿病引起的學習記憶能力損傷一致，說明影像學結果可以評價海馬區(qū)發(fā)生變化，而是否能評價神經認知障礙的發(fā)生，是本研究所致力于探討的。本研究觀察到低劑量川芎嗪治療的大鼠，其皮層和海馬區(qū)的實質水分子彌散系數顯著升高，表明皮層和海馬區(qū)神經細胞水分子彌散能力增強，細胞變性水腫得到緩解，炎癥反應下降。恰恰如我們期待的那樣，我們檢測低劑量組大鼠皮層和海馬區(qū)IL-1β和TNF-α顯著降低，神經認知障礙減輕，這可能證實了我們的假設，即我們可以用功能影像學對神經認知障礙進行評價。

慢性低灌注腦損傷是導致神經障礙和認知衰退的重要因素之一[17]，而川芎嗪可降低腦缺血后活化的巨噬細胞、浸潤性淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和促炎細胞因子的表達[18]，使微循環(huán)恢復正常；并且川芎嗪可以增加腦血流量，改善腦微循環(huán)，使血流量增加。本研究觀察到低劑量川芎嗪治療的大鼠，其灌注分數顯著增加，大鼠的學習和記憶能力得到顯著改善，進一步驗證川芎嗪可以減輕神經炎癥誘導的神經認知障礙，同時也進一步表明功能影像學可以用于神經認知障礙的評價。

綜上所述，本研究首次觀察到中藥單體川芎嗪可以減輕LPS誘導的神經認知障礙，并從IVIM D、IVIM D*和f這3個方面進行神經認知障礙緩解情況的評價。這些結果將為防治神經退行性疾病的影像學評價提供重要的實驗依據。