張廣華，巨 虎，許常林，肖宗宇△，苑 樂

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院1神經(jīng)外科，2教學(xué)管理部，青海 西寧 810001)

腦膠質(zhì)瘤是常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，具有增殖無控性、易侵襲生長和易復(fù)發(fā)的特點，預(yù)后較差，5年生存率很低[1]。大量研究表明，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展本質(zhì)上是多種基因表達(dá)異常，如抑癌基因的缺失或突變及原癌基因的表達(dá)過度，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避正常生長調(diào)控機(jī)制[2]。因此，研究腦膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)基因生物特性及機(jī)制具有重要意義。含IQ模體的GTP酶激活蛋白1(IQ motif-containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1)是一種進(jìn)化保守的多結(jié)構(gòu)域蛋白。近年來的研究表明，在肺癌、肝癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均可檢測到IQGAP1的高表達(dá)，為一個原癌基因[3-5]。已有研究證實，下調(diào)IQGAP1表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[6-7]。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducters and activators of transcription，STATs)家族成員之一，在多種腫瘤中被激活，其基因已被定義為癌基因[8]。有研究表明，抑制STAT3信號可降低腫瘤細(xì)胞生長及免疫抑制[9-10]。IQGAP1是否可調(diào)控STAT3信號影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性目前尚未明確。因此，本研究旨在探討沉默IQGAP1是否可通過調(diào)控STAT3信號影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移和免疫抑制相關(guān)因子的表達(dá)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。細(xì)胞在含有10% FBS、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)85%左右生長融合時，用胰酶消化后傳代。

2 試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS、青霉素和鏈霉素均購自Gibco；抗IQGAP1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、STAT3和p-STAT3抗體均購自Abcam ；MTT、DMSO和AG490均購自Sigma；Transwell小室試劑盒和Matrigel均購自Corning；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。凝膠成像儀購自美國Bio-Rad；倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS。

3 方法

3.1小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)序列構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實驗分為空白(blank)組、陰性對照(negative control,NC)組和si-IQGAP1組。依據(jù)GenBank中提供的IQGAP1CDS序列，根據(jù)siRNA設(shè)計原則設(shè)計IQGAP1的干擾序列及陰性對照序列，由上海吉瑪合成。序列如下：si-IQGAP1-1： 5’-GGCACAUGCAGAGAAUAAUTT-3’; si-IQGAP1-2： 5’-GCCC ACUUAAGCAUCAUUATT-3’; IQGAP1-NC: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。轉(zhuǎn)染前1 d，以5×107/L接種生長至對數(shù)期的U251細(xì)胞于6孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞達(dá)70%融合率時，將依據(jù)陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明制備的siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入6孔板，空白組僅加陽離子脂質(zhì)體，輕搖混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育6 h，棄去孔內(nèi)含siRNA的轉(zhuǎn)染試劑，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中IQGAP1的蛋白表達(dá)。

3.2MTT法檢測細(xì)胞活力 取生長狀態(tài)良好的U251細(xì)胞，以每孔5×103接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)孵育過夜，轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染后48 h，每孔細(xì)胞加MTT 20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)孵育4 h，吸去培養(yǎng)上清，每孔加DMSO 200 μL，搖床低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次，取均值。

3.3Western blot檢測IQGAP1蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，加適量RIPA裂解液在冰上裂解反應(yīng)30 min，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至離心管，離心后取上清，BCA試劑盒檢測上清中蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，依次經(jīng)10% SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)NC膜及5%脫脂奶粉封閉，加抗IQGAP1(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的兔抗鼠 II 抗(稀釋比例1 ∶3 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL顯影。ImageJ軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值比值為相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。參照上述方法檢測VEGF、TGF-β1及STAT3信號通路中STAT3和p-STAT3的蛋白水平。

3.4細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測 實驗分組同3.1。Transwell小室的上室中鋪入60 μL稀釋好的Matrigel(Matrigel與培養(yǎng)液比例為1∶3)，37 ℃條件孵育4～5 h以使其聚合成凝膠。收集轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液，以每孔1×105cells濃度每孔200 μL加入到Transwell小室的上室。Transwell小室的下室中加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)液，37 ℃孵箱中常規(guī)孵育24 h。輕輕擦掉Transwell小室面上未穿過膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛在室溫條件下固定30 min，蘇木精-伊紅染色20 min，光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個視野(包括上、中、下、左和右)，計算穿過膜的細(xì)胞數(shù)，取均值。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞侵襲能力的檢測除了未鋪Matrigel，其它方法同上。

抑制STAT3信號后細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測分為3個處理組，即空白組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、AG490組(50 μmol/L的STAT3信號抑制劑AG490處理細(xì)胞)和AG490+si-IQGAP1組(50 μmol/L AG490及si-IQGAP1同時處理細(xì)胞)。各組細(xì)胞處理48 h，參照上述方法檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。并用Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IQGAP1在腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞表達(dá)

IQGAP1 siRNA轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞后，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，si-IQGAP1-1組和si-IQGAP1-2組IQGAP1蛋白表達(dá)均顯著低于空白組(P<0.05)，NC組 IQGAP1蛋白表達(dá)與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Western blot was used for determining the protein expression of IQGAP1. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

圖1 Western blot檢測IQGAP1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)水平

2 敲減IQGAP1表達(dá)抑制U251細(xì)胞活力及侵襲和遷移能力

分別采用MTT法和Transwell小室檢測各組細(xì)胞活力及侵襲和遷移能力，結(jié)果顯示，與空白組比較，si-IQGAP1組的細(xì)胞活力及侵襲和遷移能力均明顯降低(P<0.05 )，見圖2。

3 敲減IQGAP1表達(dá)對U251細(xì)胞免疫抑制相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測各組細(xì)胞免疫抑制相關(guān)的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白組比較，si-IQGAP1組VEGF和TGF-β1的蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，見圖3。

4 敲減IQGAP1表達(dá)下調(diào)U251細(xì)胞STAT3信號通路相關(guān)分子的蛋白水平

與空白組比較，si-IQGAP1組p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，3組間STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

5 敲減IQGAP1表達(dá)增加AG490對U251細(xì)胞活力、侵襲和遷移的抑制

用STAT3信號通路抑制劑AG490和si-IQGAP1+AG490處理U251細(xì)胞，細(xì)胞侵襲及遷移能力檢測結(jié)果顯示，AG490組細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著低于空白組，而si-IQGAP1+AG490組細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著低于AG490組(P<0.05)，見圖5。

6 沉默IQGAP1表達(dá)加強(qiáng)AG490對U251細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)

AG490組的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)顯著低于空白組，而si-IQGAP1+AG490組的VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)均顯著低于AG490組(P<0.05)，見圖6。

討 論

IQGAP1基因在人體組織中有廣泛表達(dá)，尤其在細(xì)胞遷徙、細(xì)胞黏附、胞質(zhì)分裂和胞外信號等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[11]。研究表明，IQGAP1蛋白與多種重要的生物學(xué)過程相關(guān)，對多種腫瘤發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用[12]。而也有研究指出，下調(diào)IQGAP1表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長，如過表達(dá)IQGAP1可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖能力，而敲減IQGAP1表達(dá)可抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力[13]；敲減IQGAP1表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

Figure 2. The effect ofIQGAP1expression knock-down on the viability (A), invasion (B) and migration (C) of U251 cells (×400). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

圖2 沉默IQGAP1表達(dá)對U251細(xì)胞活力及侵襲和遷移能力的影響

Figure 3.Western blot was used for determining the effect ofIQGAP1expression knock-down on the protein expression of VEGF and TGF-β1 in the U251 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

圖3 沉默IQGAP1表達(dá)下調(diào)U251細(xì)胞VEGF和TGF-β1表達(dá)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是常見的在轉(zhuǎn)錄后阻斷基因表達(dá)的一種新技術(shù)，因其能高效性、特異性的抑制目的基因表達(dá)，目前在基因功能研究和基因治療等方面有廣泛的應(yīng)用[15-16]。本研究中使用RNAi技術(shù)敲減U251細(xì)胞IQGAP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IQGAP1表達(dá)的抑制可使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低。這與前人研究結(jié)果一致[6-7]。

STAT是一條可廣泛作用于腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)過程的信號途徑，STAT3是STAT家族的一個重要成員，被激活后可轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄腟TAT3，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及抑制凋亡而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[17-18]。多種腫瘤中STAT3信號異常激活，其激活與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中STAT3信號也處于激活狀態(tài)，而下調(diào)STAT3信號可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，AG490為STAT3信號抑制劑，有研究顯示，AG490可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究結(jié)果顯示，沉默IQGAP1表達(dá)可降低p-STAT3的蛋白水平；AG490可增強(qiáng)敲減IQGAP1對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。本研究結(jié)果提示，敲減IQGAP1的表達(dá)可通過下調(diào)STAT3信號抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力、侵襲和遷移能力。

Figure 4.Western blot was used for determining the effect ofIQGAP1expression knock-down on the protein levels of STAT3 and p-STAT3 in the U251 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

圖4 敲減IQGAP1表達(dá)對U251細(xì)胞STAT3信號通路的影響

Figure 5.Knock-down ofIQGAP1expression increased the inhibitory effect of AG490 on the viability (A), invasion (B) and migration (C) of U251 cells (×400). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAG490 group.

圖5 敲減IQGAP1表達(dá)增加AG490對U251細(xì)胞活力及侵襲和遷移能力的抑制作用

Figure 6.Knock-down ofIQGAP1expression promoted the inhi-bitory effect of AG490 on the protein expression of VEGF and TGF-β1 in the U251 cells (determined by Western blot). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAG490 group.

圖6 敲減IQGAP1表達(dá)加強(qiáng)AG490抑制U251細(xì)胞表達(dá)VEGF和TGF-β1的效應(yīng)

有研究表明，免疫抑制因子在腫瘤細(xì)胞、腫瘤患者血清及組織提取液中廣泛存在，能夠直接誘導(dǎo)免疫逃逸、抑制宿主的抗腫瘤免疫力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。近期已發(fā)現(xiàn)一些免疫因子如VEGF、TGF-β和IL-10等可主動抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)[23]。VEGF是一個具有多功能的細(xì)胞因子，可提高毛細(xì)血管通透性、誘導(dǎo)血管生成等，在腫瘤生長中起重要作用[24]。TGF-β是目前研究較多，也較肯定的一個免疫抑制因子，在腫瘤進(jìn)展期可抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞殺傷，并增加血管生成，刺激細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[25]。有研究表明，抑制STAT3信號可降低VEGF和TGF-β的表達(dá)[26-27]。本研究結(jié)果顯示，敲減IQGAP1可下調(diào)VEGF和TGF-β1的表達(dá)，并增強(qiáng)AG490對VEGF和TGF-β1表達(dá)的抑制效應(yīng)，提示敲減IQGAP1可能通過下調(diào)STAT3信號影響對腦膠質(zhì)瘤的免疫反應(yīng)。

由此可見，敲減IQGAP1基因的表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，下調(diào)細(xì)胞免疫抑制因子VEGF和TGF-β1的表達(dá)，機(jī)制可能與STAT3信號的下調(diào)有關(guān)。這提示IQGAP1可能是腦膠質(zhì)瘤基因治療的有效靶點。后續(xù)研究將致力于IQGAP1對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞其他生物學(xué)特性及機(jī)制的研究。