王卓文, 陳子彥, 楊柳青, 胡漢寅, 石子晴, 林仙德, 錢若文軒, 郭燕君，潘巍巍

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院生物教研室，浙江 嘉興 314001)

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，在動物模型建立、作物育種、基因治療和藥物開發(fā)等不同領(lǐng)域中都得到了廣泛應(yīng)用[1-3]。研究表明，含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白(coiled-coil domain-containing protein，CCDC)與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，如CCDC136、CCDC127和CCDC67等[4-6]。Tremblay等[7]研究表明CCDC80在白色脂肪組織中高表達(dá)。此外，CCDC80可以抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞克隆形成[8]，但在卵巢癌中的作用未見報(bào)道。本研究采用慢病毒系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對人卵巢癌ES-2細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，獲得CCDC80基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株，初步分析CCDC80基因在卵巢癌ES-2細(xì)胞增殖中的作用，為篩選卵巢癌治療的分子靶點(diǎn)提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自杭州昊鑫生物科技有限公司；退火緩沖液購自碧云天生物技術(shù)研究所；Polybrene購自Sigma；PolyJet體外DNA轉(zhuǎn)染試劑購自SignaGen；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD；FBS、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS、 胰蛋白酶和青-鏈霉素均購自HyClone；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購自TaKaRa；qPCR試劑盒購自東洋紡；免疫組化試劑盒購自ABC;β-actin、p-ERK、ERK、p-histone H3和AKT抗體購自Cell Signaling Technology;各種II抗購自Jackson Labs。

2 動物和細(xì)胞

SPF級雌性裸鼠，6～8周齡，18～20 g, 10只, 購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號為20130016009052),飼養(yǎng)在嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。ES-2卵巢癌細(xì)胞和293T細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保存。

3 主要方法

3.1慢病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9-CCDC80基因敲除載體構(gòu)建 lentiCRISPR v2，psPAX2和pMD2.G質(zhì)粒由管坤良教授贈送。用于CCDC80基因敲除的sgRNA(CCDC80-1: 5’-GGTGAGAAGGATCACCAG-CG-3’；CCDC80-2: 5’-CCTGGATAGGAAGTTCTCCA-3’)上、下游引物混合物退火體系及退火條件參見碧云天退火緩沖液說明。退火引物的磷酸化：上、下游引物混合液2 μL(100 μmol/L)，10×T4連接酶緩沖液 1 μL, T4 PNK 0.5 μL, 無菌水6.5 μL，共10 μL。LentiCRISPR v2 空載體經(jīng)BsmB Ⅰ酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的空載體，將酶切后的空載與磷酸化處理后的sgRNA連接，同時(shí)設(shè)置對照，16 ℃，8 h連接過夜。將重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用試劑盒提取連接后的質(zhì)粒，將質(zhì)粒送至上海生物工程科技有限公司測序。

3.2CCDC80基因敲除的卵巢癌細(xì)胞篩選 1.5×105293T細(xì)胞于6孔板過夜培養(yǎng)，將PolyJet轉(zhuǎn)染試劑與病毒骨架載體、病毒對照載體或CCDC80基因敲除載體混勻，轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，同時(shí)將ES-2細(xì)胞(1×105)接種于6孔板，24 h后將293T細(xì)胞的病毒上清過濾到ES-2細(xì)胞中，病毒感染ES-2細(xì)胞24～48 h后加入嘌呤霉素(2 mg/L)篩選陽性表達(dá)細(xì)胞。

3.3細(xì)胞總RNA提取和qPCR 取對照細(xì)胞和CCDC80基因敲除細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA(具體步驟參見試劑說明)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA后采用qPCR檢測mRNA表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參照，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。Apc的上游引物序列為5’-AGCAAGTTGAGGCACTGAAGA-3’,下游引物序列為5’-ACCGCAGTTTTACTCCAGGG-3’;Srpx的上游引物序列為5’-CAGCCGCAGCTTCCCAGATA-3’,下游引物序列為5’-CTCCAGGCCTTGTTGTCCAT-3’; Ppara的上游引物序列為5’-TTCGCCATGCTGTCTTCTGT-3’,下游引物序列為5’-ACGTTTAGAAGGCCAGGACG-3’; Aib1的上游引物序列為5’-GGCCAGTGATTCACG-AAAACG-3’,下游引物序列為5’-ACTTTCCTGCTCCCGTCTCC-3’; Htra1的上游引物序列為5’-GGGACTGGTCGTGTTTGTGC-3’,下游引物序列為5’-CATTGACCTTTGGGTGCTGACT-3’; osterix的上游引物序列為5’-TGCCTCCTCAGCTCACCTTC-3’,下游引物序列為5’-GCAGGTATCAGGCACAAGGG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT-3’，下游引物序列為5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’；aggrecanase-1的上游引物序列為5’-TGCCGCTTCATCACTGA-3’,下游引物序列為5’-CAATGGAGCCTCTGGTTTGTC-3’。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 取對照細(xì)胞和基因敲除細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行蛋白定量，取20 μg 總蛋白行8% SDS-PAGE, 轉(zhuǎn)至PVDF膜上, 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h, 分別孵育抗β-actin(1 ∶1 000)、 ERK (1∶1 000)、 p-ERK(1∶1 000)、 p-histone H3(1∶1 000)和 AKT抗體4 ℃過夜, PBST洗膜, 5 min，HRP標(biāo)記II抗室溫孵育1 h, PBST洗膜，5 min，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒暗房顯影。

3.5Annexin V/PI染色檢測細(xì)胞凋亡 將對照細(xì)胞和基因敲除組細(xì)胞過夜培養(yǎng)，收集細(xì)胞, 用預(yù)冷1×PBS洗滌2次, 1×Binding buffer 重懸細(xì)胞。設(shè)置空白對照、單染對照和雙染檢測組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，操作步驟按照試劑說明。

3.6軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 配制底層膠0.5W/Vagar于6孔板，室溫靜置15 min待膠凝固，配制頂層膠0.35W/Vagar，將對照細(xì)胞與基因敲除細(xì)胞與頂層膠混合，接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)為每孔3 000。室溫靜置20 min待膠凝固，放入2 mL新鮮培養(yǎng)液于頂層膠上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)14～20 d，用臺盼藍(lán)染色后計(jì)算克隆數(shù), 每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將對照細(xì)胞與基因敲除的卵巢癌細(xì)胞接種于6孔板過夜培養(yǎng)，用200 μL吸頭在培養(yǎng)皿表面劃過，在6孔板中形成劃痕，換無血清培養(yǎng)液，分別在劃痕后0 h、10 h和20 h照相, 觀察細(xì)胞的遷移。

3.8裸鼠荷瘤模型 6周齡雌性裸鼠10只，SPF級飼養(yǎng)，隨機(jī)將裸鼠分成2組, 每組各5只。無菌條件下分別給一組裸鼠的背部皮下注射5×105個(gè)對照細(xì)胞，另一組裸鼠背部注射5×105CCDC80基因敲除細(xì)胞，7 d后使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤形成大小，待腫瘤直徑≥15 mm時(shí)處死裸鼠。裸鼠腹腔注射5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU;100 mg/kg)，處死裸鼠取出皮下腫瘤組織稱重，中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片(5 μm厚)。

3.9免疫組化染色 石蠟組織經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟，水化，3%H2O2避光10 min，0.02 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，95 ℃ 15 min，室溫冷卻。M.O.M試劑盒處理按照試劑盒說明操作。ABD試劑盒室溫孵育30分鐘，PBST洗片，DAB顯色，終止，逐級脫水，封片。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件作圖。以P<0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 慢病毒介導(dǎo)CCDC80基因敲除的ES-2細(xì)胞篩選和鑒定

為了研究CCDC80基因在人卵巢癌中的作用，我們分別針對人CCDC80基因第2個(gè)外顯子和第5個(gè)外顯子設(shè)計(jì)了2個(gè)不同的敲除序列，構(gòu)建了CCDC80基因敲除的CRISPR/Cas9慢病毒載體，見圖1A、B。質(zhì)粒測序和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，Lenti-CCDC80 基因敲除(CCDC80 KO)載體構(gòu)建成功。通過在293T細(xì)胞包裝、感染ES-2細(xì)胞及嘌呤霉素篩選獲得CCDC80基因穩(wěn)定敲除的卵巢癌細(xì)胞pool。利用PCR結(jié)合測序方法鑒定，我們比對得出了缺失序列，見圖1C。這一結(jié)果表明我們成功獲得了CCDC80敲除的人卵巢癌ES-2細(xì)胞pool。

Figure 1.CCDC80deletion in ovarian cancer cells. A: indentification of vector construction; B: diagram showing the strategy ofCCDC80deletion; C: genomic sequencing ofCCDC80deletion in ovarian cancer cells.

圖1 卵巢癌細(xì)胞中敲除CCDC80基因

2 CCDC80基因敲除抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成

在正常培養(yǎng)條件下和血清饑餓條件下，CCDC80基因敲除卵巢癌細(xì)胞增殖均顯著降低(P<0.01)，見圖2A。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)是檢測腫瘤細(xì)胞增殖活力的有效方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CCDC80基因敲除顯著抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2的克隆形成能力(P<0.01)，見圖2B。CCDC80基因敲除顯著抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2的遷移能力(P<0.01)，見圖2C。

Figure 2.CCDC80deletion inhibited cell proliferation and migration.A:CCDC80deletion inhibited cell proliferation in normal condition and starvation condition; B:CCDC80deletion inhibited cell colony number; C:CCDC80deletion repressed cell migration. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖2CCDC80敲除抑制細(xì)胞增殖和遷移

3 CCDC80基因敲除促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞ES-2凋亡

CCDC80基因敲除后卵巢癌ES-2細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少，S期細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，G2期細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)，見圖3A。Annexin V/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，CCDC80基因敲除后凋亡細(xì)胞數(shù)達(dá)到17.5%，而對照組凋亡細(xì)胞數(shù)只有6%，兩者差異顯著(P<0.01)，見圖3B。

4 CCDC80基因敲除抑制裸鼠體內(nèi)成瘤

注射對照細(xì)胞的裸鼠形成的腫瘤體積是注射CCDC80基因敲除細(xì)胞的2倍，實(shí)驗(yàn)組和對照組形成的腫瘤體積差異顯著(P<0.01)，見圖4A；免疫組化檢測顯示CCDC80基因敲除細(xì)胞形成的腫瘤組織DNA損傷蛋白p-H2AX高表達(dá)，而細(xì)胞增殖標(biāo)志物BrdU低表達(dá)，見圖4B。

5 CCDC80基因敲除通過抑制Aib1表達(dá)和影響MAPK信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2增殖

CCDC80基因敲除顯著抑制了卵巢癌ES-2細(xì)胞Aib1的mRNA表達(dá)(P<0.01)。此外，CCDC80基因敲除也顯著抑制了aggencanase-1和osterix的mRNA表達(dá)量(P<0.01),見圖5A。Western blot檢測結(jié)果顯示，CCDC80基因敲除后增殖蛋白p-histone H3表達(dá)量顯著降低，p-ERK1/2表達(dá)量增加，見圖5B。

Figure 3.CCDC80deletion promoted the cell apoptosis. A:CCDC80deletion affected cell cycle; B:CCDC80deletion promoted apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖3CCDC80敲除促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡

Figure 4.CCDC80deletion repressed cell growthinvivo. A: the tumor size and weight； B: IHC staining for BrdU expression in tumor tissues (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.

圖4 在體內(nèi)CCDC80缺失抑制卵巢癌細(xì)胞增殖

討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其致死率在所有女性癌癥中居于第5位。近年卵巢癌逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢,發(fā)病率逐年上升，但卵巢癌發(fā)生的具體機(jī)制并不清楚。因此，尋找新的卵巢癌早期篩選標(biāo)記分子及基因治療的分子靶標(biāo)，成為卵巢癌研究的熱點(diǎn)問題。CRISPR與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵的免疫系統(tǒng)有關(guān)[9]。近年CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由于其簡單高效的敲除特點(diǎn)廣泛用于人類疾病動物和細(xì)胞模型的研究[10-11]。慢病毒是常用的外源基因體外傳遞系統(tǒng)，不僅可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細(xì)胞，還可以將其攜帶的sgRNA高效整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，使得sgRNA可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，這些優(yōu)勢是其他外源基因傳遞系統(tǒng)所沒有的[12-13]。因此本研究將慢病毒系統(tǒng)與CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)結(jié)合起來，簡單高效敲除人卵巢癌ES-2細(xì)胞CCDC80基因。

Figure 5.CCDC80deletion decreased Aib1 expression. A:CCDC80deletion decreased Aib1, aggrecanase-1 and osterix mRNA expression. B: p-histone H3, AKT and p-ERK1/2 protein levels detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖5CCDC80敲除抑制Aib1表達(dá)

CCDC80蛋白(也稱down-regulated by oncogenes 1, DRO1)在甲狀腺癌、乳頭狀癌、胰腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系中低表達(dá)，而在脂肪組織中高表達(dá)[14-15]。研究表明，DRO1參與結(jié)腸癌受體介導(dǎo)凋亡途徑[8]，CCDC80異常表達(dá)抑制癌細(xì)胞生長，這些結(jié)果顯示CCDC80作為抑癌基因發(fā)揮作用[16]。CCDC80在卵巢癌細(xì)胞中的作用至今不清楚。本研究通過慢病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9敲除卵巢癌ES-2細(xì)胞的CCDC80基因，結(jié)果表明卵巢癌ES-2細(xì)胞增殖能力、軟瓊脂克隆形成能力和遷移能力顯著降低。裸鼠荷瘤模型顯示CCDC80基因敲除體內(nèi)也顯著抑制ES-2細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示CCDC80基因在卵巢癌ES-2細(xì)胞中可能作為癌基因發(fā)揮作用。

為了尋找CCDC80蛋白在卵巢癌細(xì)胞中的下游靶基因，查閱文獻(xiàn)表明DRO1與Aib1共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[17]。Aib1作為核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共激活因子發(fā)揮癌基因的作用[18],并且在非腫瘤細(xì)胞中Aib1核質(zhì)間定位與細(xì)胞周期有關(guān)[19]。qPCR檢測顯示，在CCDC80基因敲除的卵巢癌ES-2細(xì)胞中Aib1 mRNA表達(dá)顯著降低,提示CCDC80基因敲除抑制了Aib1基因的轉(zhuǎn)錄。此外，在CCDC80基因敲除的卵巢癌細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)顯著增加，說明在卵巢癌細(xì)胞中CCDC80基因敲除還可以影響MAPK/ERK信號通路。本研究表明了CCDC80基因在卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移中的作用，并且找到了下游的靶基因Aib1，這為尋找卵巢癌治療的分子靶點(diǎn)提供了參考資料。