方雪嬌，徐建昕，王思萱，龍露葉，管 晨，錢詩(shī)菡，呂建新

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

大多數(shù)國(guó)家女性腫瘤患者中乳腺癌的診斷率和腫瘤相關(guān)死亡率均位居第1位。據(jù)預(yù)測(cè)，2018年全球范圍內(nèi)女性乳腺癌新增患者將達(dá)210萬(wàn)，占據(jù)女性腫瘤患者人數(shù)的四分之一[1]。乳腺癌根據(jù)細(xì)胞膜上受體[雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER-2)]表達(dá)不同而分為4種類型，其中3種受體均不表達(dá)的三陰性乳腺癌由于缺乏有效的治療措施而成為當(dāng)前乳腺癌治療的一大難題。三陰性乳腺癌的預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高成為乳腺癌致死的主要原因[2]，因此探索和挖掘有效的治療方法迫在眉睫。

他莫昔芬(tamoxifen，Tam)是雌激素受體拮抗劑，在體內(nèi)與雌激素競(jìng)爭(zhēng)受體，從而阻斷雌激素發(fā)揮作用，主要用于ER陽(yáng)性乳腺癌的治療；近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在ER陰性的乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和膽管癌等腫瘤中，他莫昔芬以雌激素非依賴的方式發(fā)揮作用[3]。二甲雙胍(metformin，Met)廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療，通過(guò)激活A(yù)MP活化的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]，促進(jìn)肌肉攝取血液中的葡萄糖而達(dá)到降糖目的。研究顯示，二甲雙胍可以降低糖尿病患者的腫瘤發(fā)生率和腫瘤相關(guān)死亡率[4]。因此，近年來(lái)二甲雙胍用于腫瘤研究的熱度不減。轉(zhuǎn)錄因子MYC家族3個(gè)成員MYC、MYCN和MYCL1中，前者研究頗多。由其編碼的蛋白c-Myc，通過(guò)與MAX形成異源二聚體，識(shí)別并結(jié)合DNA上的CACGTG序列發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Horiuchi等[5]利用生物信息學(xué)技術(shù)和I-SPY數(shù)據(jù)分析乳腺癌中c-Myc的表達(dá)以三陰性乳腺癌偏高；Korangath等[6]的研究中顯示MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞HMEC1，且異常升高的c-Myc促進(jìn)了三陰性乳腺癌的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡作用[5]。

Kang 等[7]以1 mmol/L的他莫昔芬作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72 h后c-Myc的mRNA水平升高了5倍，蛋白水平升高了3倍；他莫昔芬耐藥的MCF-7細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)水平更高[8]；他莫昔芬敏感的細(xì)胞中，他莫昔芬通過(guò)靶向mircoRNA-320a/ARPP-19/ERRY/c-Myc影響了MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞的增殖和平板集落形成[9]，這說(shuō)明他莫昔芬與c-Myc之間存在著關(guān)聯(lián)。二甲雙胍抑制唾液腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度和時(shí)間依賴性，同時(shí)抑制c-Myc蛋白表達(dá)；二甲雙胍調(diào)控JAK/STAT3/c-Myc通路阻止食管鱗狀細(xì)胞腫瘤微環(huán)境引起的正常上皮向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[10]；前期的工作也表明二甲雙胍可以抑制乳腺癌細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)[11]。二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬的協(xié)同作用已在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中得到驗(yàn)證[12-15]，但是在三陰性乳腺癌中研究甚少，更不曾體內(nèi)水平驗(yàn)證兩藥聯(lián)合的協(xié)同作用。因此本文對(duì)此進(jìn)行了探討，在體內(nèi)和體外水平證明了二甲雙胍與他莫昔芬聯(lián)合使用對(duì)三陰性乳腺癌有協(xié)同抗腫瘤作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

三陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(Biological Industries)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素(Solarbio)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中，放置于溫度為37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡SCID雌性小鼠16只購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

3 主要試劑

二甲雙胍、他莫昔芬和DMSO購(gòu)自中國(guó)上海西格瑪奧德里奇公司。二甲雙胍以PBS配制成濃度為1 mol/L的原液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，他莫昔芬則用DMSO為溶劑配成濃度為10 mmol/L的原液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

4 主要方法

4.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞胰酶消化后,配制3.5×107/L的懸液，再以100 μL懸液接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，每孔加入100 μL含有不同藥物[0.1% DMSO(control組)、18.75 μmol/L他莫昔芬(Tam組)、5 mmol/L二甲雙胍(Met組)或5 mmol/L二甲雙胍+18.75 μmol/L他莫昔芬(Met+Tam組)]的DMEM培養(yǎng)基，作用24、48和72 h后，加入CCK-8工作液100 μL，37 ℃孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處的吸光度(A)值，繪制生長(zhǎng)曲線。

4.2平板集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1×103個(gè)鋪于6孔板內(nèi)。 72 h后按分組更換為2 mL含有不同藥物的DMEM培養(yǎng)基，每3 d更換 1 次培養(yǎng)基，直至形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落。隨后進(jìn)行4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，室溫干燥后進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算相對(duì)集落形成率。

4.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1.5×105鋪于6孔板，24 h細(xì)胞貼壁后，更換為含有0.1% DMSO、18.75 μmol/L他莫昔芬、5 mmol/L二甲雙胍及5 mmol/L二甲雙胍+18.75 μmol/L他莫昔芬的培養(yǎng)基持續(xù)作用72 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，將含有annexin V-FITC和PI的結(jié)合緩沖液500 μL加入細(xì)胞沉淀中，重懸后室溫避光孵育，在15 min至1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，統(tǒng)計(jì)并分析細(xì)胞凋亡率。

4.4Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸混勻并計(jì)數(shù)。Transwell小室上室加入200 μL細(xì)胞懸液(MDA-MB-231細(xì)胞為2×104個(gè))，下室加入600 (L含20% FBS的培養(yǎng)基用于誘導(dǎo)細(xì)胞向下遷移，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，取出小室，棄上室內(nèi)培養(yǎng)基后將小室放入4%多聚甲醛中固定20 min，去掉多聚甲醛，室溫晾干后放入結(jié)晶紫中染色20 min,棉簽輕輕擦凈上室細(xì)胞及染料，10×10倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)，比較各組間細(xì)胞數(shù)的差異。

4.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 4 ℃冰上過(guò)夜融化基質(zhì)膠，按照基質(zhì)膠∶DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基=1∶9的比例配制所需體積混合液，混勻后每孔40 μL混合液加入小室上室，于37 ℃溫育12 h使基質(zhì)膠完全聚合。種植細(xì)胞前吸去小室內(nèi)殘余液體，每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基原液水化30 min，其余步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

4.6Western blot實(shí)驗(yàn) 用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白。經(jīng)10% SDS-PEAG電泳后轉(zhuǎn)膜1 h，室溫脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃的 I 抗(c-Myc 1∶2 000，β-actin 1∶1 000)孵育過(guò)夜；室溫 II 抗孵育1 h；SuperSignal Protein Detection Kit增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad凝膠成像儀系統(tǒng)曝光獲取圖像。

4.7小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 雌性SCID小鼠16只飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，隨機(jī)分為對(duì)照組、二甲雙胍組、他莫昔芬組和二甲雙胍+他莫昔芬組。收集MDA-MB-231細(xì)胞，以8×106個(gè)細(xì)胞注射到小鼠右側(cè)腹部皮下，15 d后，每組小鼠分別接受相應(yīng)的處理。對(duì)照組：生理鹽水;二甲雙胍組：125 mg/kg；他莫昔芬組：60 mg/kg；二甲雙胍+他莫昔芬組：125 mg/kg+60 mg/kg。其中二甲雙胍溶于生理鹽水，他莫昔芬溶于玉米油。此后每 3 d進(jìn)行 1 次如上處理。21 d后處死小鼠，剝?nèi)×鲶w并進(jìn)行下一步分析。

4.8免疫組化分析 4% 多聚甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋，切片、脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、5% BSA封閉切片，加入c-Myc抗體(5 mg/L)4 ℃孵育過(guò)夜、室溫 II 抗30 min、SABC室溫30 min、DBA顯色、蘇木精復(fù)染。5% BSA作為陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察棕色顆粒，并于400倍鏡下拍照。利用Image-Pro Plus軟件分析其積分吸光度。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)采用3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用單因素方差分析(one-way AVONA)比較各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 二甲雙胍增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。當(dāng)他莫昔芬濃度為18.75 μmol/L、二甲雙胍濃度為5 mmol/L及作用時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，抑制作用明顯增強(qiáng)，因此選擇此藥物濃度及作用時(shí)間做后續(xù)研究。當(dāng)他莫昔芬和二甲雙胍聯(lián)合作用于MDA-MB-231細(xì)胞72 h后，細(xì)胞活力為對(duì)照組的53.8%，明顯低于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

為進(jìn)一步探討聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，我們檢測(cè)了處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)不同處理培養(yǎng)72 h后的集落形成能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照和單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的集落形成能力的抑制率為72%，顯著高于對(duì)照組、他莫昔芬組和二甲雙胍組(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖2。這一結(jié)果表明聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用大于單獨(dú)用藥。

2 二甲雙胍促進(jìn)他莫昔芬誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

利用Annexin V-FITC/PI熒光雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩藥單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的影響。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率為11.6%，高于對(duì)照組、他莫昔芬組和二甲雙胍組(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

3 二甲雙胍增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力的抑制作用

在Transwell實(shí)驗(yàn)中，不同處理作用72 h，MDA-MB-231細(xì)胞從小室上層向下層的遷移和侵襲能力明顯減弱，兩藥聯(lián)合組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)減少的程度更顯著(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 1.Metformin (Met) enhanced the inhibition of the viability of MDA-MB-231 cells induced by tamoxifen (Tam). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.

圖1 二甲雙胍增強(qiáng)了他莫昔芬對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用

Figure 2.Metformin (Met) enhanced tamoxifen (Tam)-induced inhibition of the colony formation of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.

圖2 二甲雙胍增強(qiáng)了他莫昔芬對(duì)MDA-MB-231集落形成能力的抑制作用

Figure 3.Metformin (Met) promoted the apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by tamoxifen (Tam). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.

圖3 二甲雙胍促進(jìn)他莫昔芬誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

Figure 4.Metformin (Met) enhanced tamoxifen (Tam)-induced inhibition of migration (A) and invasion (B) abilities of MDA-MB-231 cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.

圖4 二甲雙胍增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用

4 二甲雙胍對(duì)他莫昔芬的增效作用與c-Myc蛋白表達(dá)下降相關(guān)

當(dāng)二甲雙胍和他莫昔芬單獨(dú)作用于MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，c-Myc蛋白表達(dá)出現(xiàn)輕微下降；而聯(lián)合用藥后c-Myc蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effect of combination use of metformin (Met) and tamoxifen (Tam) on down-regulation of c-Myc protein expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;&&P<0.01vsTam group;##P<0.01vsMet group.

圖5 二甲雙胍對(duì)他莫昔芬的增效作用與c-Myc蛋白表達(dá)下降相關(guān)

5 二甲雙胍增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)SCID小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制

經(jīng)過(guò)二甲雙胍和他莫昔芬處理后，小鼠腫瘤體積明顯減?。蝗欢鴥伤幝?lián)合組對(duì)腫瘤體積的影響較對(duì)照組和單獨(dú)用藥組更為顯著，見(jiàn)圖6A、B。單獨(dú)用藥組小鼠腫瘤重量與對(duì)照組比較有輕微下降，而聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤的重量明顯低于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(P<0.05)，見(jiàn)圖6C。利用Western blot檢測(cè)二甲雙胍和他莫昔芬單獨(dú)或聯(lián)合作用后腫瘤組織中c-Myc蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示c-Myc蛋白表達(dá)均受到抑制，聯(lián)合用藥組抑制程度更大(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖6D；同樣的結(jié)果通過(guò)免疫組化對(duì)c-Myc蛋白定量得到驗(yàn)證，見(jiàn)圖6E。這與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

討 論

三陰性乳腺癌相關(guān)研究和論著逐年增加[2]。因受體蛋白表達(dá)缺乏，導(dǎo)致患者對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感，主要依靠化療。三陰性乳腺癌因預(yù)后差、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高，中位生存期不超過(guò)18個(gè)月[16]，因此探索新的治療方式改善病人預(yù)后至關(guān)重要。

絕經(jīng)前ER陽(yáng)性原發(fā)性乳腺癌，輔以他莫昔芬治療2年，總體死亡率影響甚微，乳腺癌相關(guān)死亡率降低顯著。研究指出服用他莫昔芬5年，對(duì)女性健康有保護(hù)作用[17]。英國(guó)國(guó)家健康與臨床卓越研究所2013年制定將他莫昔芬作為乳腺癌預(yù)防措施之一。早期研究表明他莫昔芬對(duì)ER陰性乳腺癌無(wú)明顯效果，而近期的研究表明ER陰性乳腺癌也可以從他莫昔芬治療中受益[18]。二甲雙胍作為2型糖尿病治療藥物已有60多年歷史[19],其藥效安全性已被證實(shí)，單一用藥無(wú)副作用，對(duì)體重?zé)o明顯影響[20]。

在本研究中，二甲雙胍與他莫昔芬單獨(dú)作用均能抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合后增強(qiáng)了這些作用；另外，二甲雙胍和他莫昔芬單獨(dú)用藥致c-Myc蛋白出現(xiàn)輕微下降，聯(lián)合作用后顯著抑制了c-Myc蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，二甲雙胍和他莫昔芬單獨(dú)或聯(lián)合能抑制人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞移植SCID小鼠皮下的瘤體生長(zhǎng)，且腫瘤組織中c-Myc蛋白表達(dá)量明顯下降。以上結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致。在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中，二甲雙胍協(xié)同他莫昔芬激活了AMPK/mTOR/p70S6、PARP/caspase7[13]和EGFR/HER/Akt[15]等，本研究最初對(duì)MAPK通路進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK、p-ERK、JNK和p-JNK均未發(fā)生改變。文獻(xiàn)報(bào)道異常升高的c-Myc與三陰性乳腺癌的惡性行為相關(guān)[5]，且二甲雙胍通過(guò)抑制與周期相關(guān)蛋白的合成從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此對(duì)c-Myc蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬影響了c-Myc蛋白的表達(dá)，這與其他學(xué)者報(bào)道的二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬能都抑制c-Myc蛋白表達(dá)相一致[14]。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍與他莫昔芬共同處理三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞能顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)能同時(shí)抑制腫瘤的c-Myc蛋白表達(dá)。雖然聯(lián)合用藥作用的具體機(jī)制尚未研究清楚，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三陰性乳腺癌的藥物治療提供了新的依據(jù)。

Figure 6.Metformin (Met) enhanced the inhibitory effect of tamoxifen (Tam) on xenograft tumor growth in the SCID mice. A and B: the images of the growth and size of xenograft tumors in the SCID mice with different treatments; C: the changes of the xenograft tumor weight in different groups; D: the effects of different treatments on the protein expression level of c-Myc in the xenograft tumor tissues; E: the result of immunohistochemical staining of the xenograft tumor tissues in different groups (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.05vsMet group.

圖6 二甲雙胍增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)SCID小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用