李文學(xué)，肖瑞剛，呂苗苗，丁寧，石華榮，顧沛雯

（1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，銀川 750021）

0 引言

【研究意義】由葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）引起的葡萄霜霉病遍及世界各葡萄產(chǎn)區(qū)，是危害最嚴(yán)重的葡萄葉部病害之一[1］。一般年份葡萄霜霉病導(dǎo)致的葡萄減產(chǎn)約為 10%—20%，葡萄霜霉病流行年份可達(dá) 50%—80%，甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重制約葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3］。葡萄霜霉病是一種典型的流行性病害[4］，病菌從侵入到發(fā)病需要 3—5 d[5］。在條件適宜時(shí)，從田間出現(xiàn)中心病株到全田普發(fā)，僅需10—15 d[6］。葡萄霜霉病菌是營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)專性寄生的真菌，目前人工無(wú)法培養(yǎng)，在一定程度上制約了葡萄霜霉病菌的早期診斷[7］、監(jiān)測(cè)[4,8］和群體遺傳分化[9-10］等方面的研究。尤其在病害潛伏侵染期間，傳統(tǒng)的檢測(cè)鑒定時(shí)間長(zhǎng)，給該病害的防控工作帶來(lái)極大的困難。因此，建立葡萄霜霉病早期的快速、便捷、定量的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于指導(dǎo)該病害防控工作具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄霜霉病菌的檢測(cè)方面，傳統(tǒng)的方法是保濕培養(yǎng)、活體接種純化菌株、顯微觀察和形態(tài)鑒定[11-12］，其程序繁瑣、周期長(zhǎng)，且無(wú)法定量研究[7,13］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)多種分子檢測(cè)手段廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)和定量研究，如常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，real-time PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification method，LAMP）。李榮[14］利用真菌的rDNA-ITS、β-tubulin和Cyt b基因序列研究了葡萄霜霉病菌菌株的遺傳變異，得出Cyt b基因序列的辨析度最高，分類效果最清晰；秦文韜等[15］根據(jù)葡萄霜霉病菌細(xì)胞色素 c氧化酶亞型 2（cytochrome c oxidase II，cox2）基因設(shè)計(jì)特異性引物，檢測(cè)了 78份來(lái)自國(guó)內(nèi)不同葡萄產(chǎn)區(qū)的葡萄霜霉病菌樣本，準(zhǔn)確率達(dá)100%。Real-time PCR是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems，ABI）公司推出的通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化進(jìn)行核酸定量的技術(shù)[16］，主要應(yīng)用于分子快速檢測(cè)和定量研究。隨著該技術(shù)在植物病害診斷和防控工作中的快速發(fā)展，在指導(dǎo)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。ZHENG等[17］構(gòu)建了定量檢測(cè)小麥白粉病菌（Blumeria graminisf. sp. tritici）在葉片中潛伏侵染量的real-time PCR方法，通過人工和自然接種的方式進(jìn)行田間小麥白粉病菌的早期監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)小麥白粉病的早期預(yù)測(cè)與防控；孫炳劍等[18］建立了基于小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）β-tubilin的SYBR Green I real-time PCR體系，確定了病原菌DNA拷貝數(shù)與接種量及病情指數(shù)的相關(guān)關(guān)系；賀字典等[19］構(gòu)建了定量檢測(cè)土壤中棘孢木霉（Trichoderma asperellum）定殖的real-time PCR方法，并對(duì)防治黃瓜枯萎病后該生防木霉菌數(shù)量在土壤中的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了檢測(cè)；DUVIVIER等[20］利用real-time PCR技術(shù)研究小麥葉銹病的流行學(xué)，定量檢測(cè)了孢子捕捉器捕獲的空中小麥葉銹菌（Puccinia triticina）夏孢子量，探討空中夏孢子量與病害嚴(yán)重度之間的關(guān)系；謝學(xué)文等[21］構(gòu)建了短密木霉（Trichoderma brevicompactum）的real-time PCR體系，示蹤短密木霉對(duì)辣椒疫霉（Phytophthora capsici）在南瓜根際土中的動(dòng)態(tài)變化，揭示根際微生物的拮抗過程。在霜霉病菌的定量研究方面，VALSESIA等[22］利用探針法對(duì)葉片中的葡萄霜霉病菌進(jìn)行了相對(duì)定量研究；LEE等[23］建立了定量檢測(cè)黃瓜葉部古巴假霜霉（Pseudoperonospora cubensis）的real-time PCR方法；張娜等[24］構(gòu)建了基于甜菜霜霉病菌（Peronospora farinosa）cox2的 SYBR Green Ⅰreal-time PCR方法，該體系檢測(cè)靈敏度為100 fg病菌DNA?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前人定性檢測(cè)葡萄霜霉病菌的研究基礎(chǔ)上，根據(jù)葡萄霜霉病菌cox2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建real-time PCR分子檢測(cè)體系；通過人工接種的方法，研究潛育期葡萄葉片菌含量與接種時(shí)間的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建快捷、準(zhǔn)確和定量檢測(cè)葡萄霜霉病菌的real-time PCR方法，分析葡萄霜霉病菌在葡萄葉部潛育期菌含量的動(dòng)態(tài)變化，建立相關(guān)模型，為田間葡萄霜霉病早期預(yù)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和防治決策提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年6月至2018年10月在寧夏大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室和寧夏葡萄與葡萄酒研究院生理實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 主要儀器和試劑

qTOWER 2.2熒光定量PCR儀（Jena公司，德國(guó)）；Azure c200凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems公司，美國(guó)）；Simpli Nano超微量分光光度計(jì)（GE公司，美國(guó)）；電泳儀（北京六一廠）；真菌 DNA提取試劑盒（Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit，BioFlux公司，日本）；植物DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?HP Plant DNA Mini Kit，Omega Bio-tek公司，美國(guó)）；膠純化試劑盒（Universal DNA Purification Kit，天根生化公司）；質(zhì)粒DNA小量試劑盒（AxyPrep?Plasmid Miniprep Kit，CORNING公司，美國(guó)）；EcoTaq?PCR SuperMix（+dye）、TransStart?Tip Green qPCR SuperMix（全式金公司）。

1.2 材料

14種葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌包括葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫蘆白粉病菌（Sphaerothecafuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、馬鈴薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（表 1）。其中馬鈴薯干腐病菌、西瓜枯萎病菌和哈茨木霉由寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所沈瑞清研究員提供，其他菌株由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室純化保存。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA的提取 稱取0.5 g葡萄葉片，利用E.Z.N.A.?HP Plant DNA Kit（OMEGA 公司）提取葡萄葉片總DNA；稱取真菌菌絲體 0.1 g，用Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux 公司）提取真菌菌絲體DNA。超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及OD值，DNA濃度均稀釋至200 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 使用Primer Premier 5.0，根據(jù) GenBank中葡萄霜霉病菌的cox2基因序列（登錄號(hào)：HM628756.1、KC774622.1、KJ654170.1、KP684908.1、KT944077.1等）設(shè)計(jì)2對(duì)引物F-Pv（5′-CA AGATCCAGCAACTCCAGTTATGGA-3′）/R-Pv（5′-ACATTGTCCATAAAAAACACCTTGT-3′）和 F-cox-Pv（5′-TCGTGTATTGATTACTGCGTCAAA-3′）/R-Pv，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.3 引物特異性檢查 對(duì)提取的上述（表 1）13種葡萄、白菜、辣椒、甘草、西葫蘆、番茄、馬鈴薯、西瓜上的病原菌和1種拮抗菌（T. harzianum）的DNA，以 ddH2O為空白對(duì)照，用引物對(duì) F-Pv/R-Pv和F-cox-Pv/R-Pv進(jìn)行常規(guī)PCR和real-time PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物特異性。

表1 供試菌株Table 1 Tested strains

常規(guī)PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×EcoTaq?PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃ ∞。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

Real-time PCR反應(yīng)體系（20 μL）：以SYBR Green Ⅰ為熒光染料，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，正反引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，模板 DNA 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足。Real-time PCR反應(yīng)條件（三步法）：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，59℃退火15 s，72℃延伸30 s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。PCR循環(huán)結(jié)束后，加熱至 95℃后降至 60℃并保持 15 s，然后按照 5℃·s?1升溫至 95℃，在升溫時(shí)每 0.5℃收集熒光信號(hào)一次，建立熔解曲線，熔解曲線分析中有單一特異的峰為判斷引物特異性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 優(yōu)化 real-time PCR反應(yīng)退火溫度 為提升real-time PCR反應(yīng)擴(kuò)增特異性，優(yōu)化退火溫度（annealing temperature，Tm）。按1.3.3 real-time PCR反應(yīng)體系及條件，以擴(kuò)增曲線和熔解曲線熒光值（ΔRn）最高、循環(huán)閾值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，cycle threshold，Ct）最小且在熔解曲線分析中有單一吸收峰為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行最佳退火溫度的優(yōu)化。

1.3.5 靈敏度檢測(cè) 基因組DNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度后按 10倍稀釋，分別釆用常規(guī) PCR和real-time PCR的擴(kuò)增方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增片段的有無(wú)和熒光值的大小，評(píng)價(jià)引物在兩種PCR技術(shù)下對(duì)葡萄霜霉病菌DNA檢測(cè)的靈敏度。

1.3.6 重組質(zhì)粒的制備 葡萄霜霉病菌特異性引物F-cox-Pv/R-Pv擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pEASY?-T1 Simple Cloning Vector于25℃連接后，轉(zhuǎn)至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單克隆，轉(zhuǎn)于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。提取重組質(zhì)粒，使用PCR驗(yàn)證和測(cè)序（生工生物工程（上海）有限公司）的方法檢測(cè)是否正確插入目的片段。超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度，根據(jù)摩爾定律，計(jì)算單位體積質(zhì)粒所含的DNA拷貝數(shù)濃度。

質(zhì)?？截悢?shù)=[質(zhì)粒濃度（ng·μL-1）×質(zhì)粒體積（μL）×6.02×1023］/[（載體長(zhǎng)度bp+片段長(zhǎng)度bp）×660 g·mol-1］

1.3.7 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法有效性檢驗(yàn) 將定量后的高拷貝數(shù)重組質(zhì)粒按 10倍梯度進(jìn)行稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品。用引物 F-cox-Pv/R-Pv進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，選擇熒光值穩(wěn)定且線性比例良好的濃度范圍，以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為x軸、Ct值為y軸，構(gòu)建real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線（由軟件real-time PCR soft 3.2生成）。根據(jù)real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率、PCR擴(kuò)增效率等，驗(yàn)證該方法的有效性。其中，相關(guān)系數(shù)R2＞0.98；曲線斜率為-3.0—-3.5；PCR擴(kuò)增效率（E）為0.9—1.2；標(biāo)準(zhǔn)偏差＜0.2；real-time PCR 擴(kuò)增效率 E＝10(-1/斜率)-1。

1.3.8 Real-time PCR定量檢測(cè)接種后葉片中病原菌含量 選用在? MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，根系達(dá)到4—5根的赤霞珠葡萄無(wú)菌組培苗，摘取大小相似的葉片進(jìn)行接種試驗(yàn)。葡萄霜霉病菌來(lái)源于田間發(fā)病初期的葡萄葉片，取回后無(wú)菌水沖洗表面灰塵，氣候培養(yǎng)箱中 24℃、相對(duì)濕度 95%的黑暗條件下進(jìn)行保濕培養(yǎng)，至葉背密集長(zhǎng)出新的霉層，選取霉層厚度一致的部位，用1.5 cm打孔器打取病斑葉盤，將葉盤霉層直接與無(wú)菌組培苗葉背拓貼接菌，一葉一盤。在氣候培養(yǎng)箱中24℃、相對(duì)濕度95%的黑暗條件下保濕培養(yǎng)6 h，去掉葉盤，共接種葡萄葉片30片，以空白無(wú)菌組培苗葉片為對(duì)照；在氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6、12、24、48、72和96 h（接種96 h后葉片出現(xiàn)霉層）收集接種葉片，每處理重復(fù)3次。將葡萄葉片無(wú)菌水清洗，剪碎，混勻，稱取0.5 g，按照1.3.1的方法提取葡萄葉片總DNA。用引物F-cox-Pv/R-Pv進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，應(yīng)用已構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算潛育期葉片中葡萄霜霉病菌的帶菌量（反應(yīng)體系和條件同1.3.3），建立接種葉片內(nèi)霜霉病菌DNA量隨時(shí)間變化的定量關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件 IBM SPSS Statistics 19.0的Regression-Curve Estimation程序進(jìn)行曲線模擬。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性驗(yàn)證

應(yīng)用引物F-Pv/R-Pv和F-cox-Pv/R-Pv對(duì)葡萄霜霉病菌、12株植物病原菌和1株拮抗菌（表1）的DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示僅葡萄霜霉病菌DNA擴(kuò)增出570和139 bp的目標(biāo)條帶，而其他供試菌DNA和清水對(duì)照等均未擴(kuò)增出條帶（圖1）。應(yīng)用引物F-cox-Pv/Pv-R進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明該引物僅對(duì)葡萄霜霉病菌有唯一的產(chǎn)物吸收峰（圖2）。

圖1 引物F-Pv/R-Pv（A）和F-cox-Pv/R-Pv（B）特異性檢測(cè)Fig. 1 Specificity detection of P. viticola primers F-Pv/R-Pv (A) and F-cox-Pv/ R-Pv (B) by using genomic DNA with conventional PCR

圖2 Real-time PCR熔解曲線Fig. 2 Melting curves of real-time PCR amplification

2.2 引物靈敏度檢測(cè)

利用 10倍濃度梯度稀釋的基因組 DNA對(duì)引物F-Pv/R-Pv和F-cox-Pv/R-Pv進(jìn)行常規(guī)PCR靈敏度測(cè)定，結(jié)果表明常規(guī) PCR的檢測(cè)靈敏度為1.0×10-2ng·μL-1（圖 3）；Real-time PCR 技術(shù)利用引物對(duì)F-cox-Pv/R-Pv的檢測(cè)靈敏度為1.0×10-4ng·μL-1（圖 4），是常規(guī) PCR檢測(cè)靈敏度的 100倍。

圖3 引物F-Pv/R-Pv（A）和F-cox-Pv/R-Pv（B）常規(guī)PCR靈敏度檢測(cè)Fig. 3 Sensitivity detection of P. viticola primers F-Pv/R-Pv (A) and F-cox-Pv/R-Pv (B) by using series genomic DNA dilutions with conventional PCR

圖4 Real-time PCR檢測(cè)引物靈敏度Fig. 4 Sensitivity detection of P. viticola primers with real-time PCR

2.3 Real-time PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化

優(yōu)化real-time PCR反應(yīng)退火溫度（Tm），提升反應(yīng)擴(kuò)增特異性。以引物對(duì)F-cox-Pv/R-Pv常規(guī)PCR最優(yōu)Tm值57℃為基礎(chǔ)，采用線性±1℃篩選最優(yōu)Tm值（圖5）。結(jié)果表明引物對(duì)F-cox-Pv/R-Pv在 59℃時(shí)獲得最小Ct值（圖5-A）和最高熒光強(qiáng)度（圖5-A、5-B），為最優(yōu) Tm值，因此選擇59℃作為葡萄霜霉病菌real-time PCR反應(yīng)的Tm值。

圖5 Real-time PCR反應(yīng)Tm值的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of Tm value of real-time PCR assays

2.4 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及方法有效性檢驗(yàn)

2.4.1 重組質(zhì)粒的制備 成功將目的片段插入到pEASY?-T1 Simple克隆載體，常規(guī)PCR檢測(cè)插入的片段大小約140 bp（圖6），與測(cè)序結(jié)果139 bp一致；提取的重組質(zhì)粒濃度和純度（A260/A280=1.874）均較高，重組質(zhì)粒的制備符合試驗(yàn)要求。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及方法有效性檢驗(yàn) 重組質(zhì)粒以10倍梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，引物F-cox-Pv/R-Pv的擴(kuò)增對(duì)數(shù)曲線規(guī)律較好（圖7-A）；以不同稀釋梯度的質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)數(shù)為x軸、Ct值為y軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7-B），該體系線性關(guān)系良好（y=42.27-3.36x），相關(guān)系數(shù)R2=0.9968，斜率為-3.36，截距為42.27，擴(kuò)增效率為98.50%，線性范圍達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)（2.4×103—2.4×109copies/μL）。

圖6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 6 Construction of recombinant plasmid

圖7 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig. 7 Establishment of real-time PCR standard curve

2.5 潛伏侵染葉片中病原菌的real-time PCR定量測(cè)定

應(yīng)用構(gòu)建的real-time PCR體系測(cè)定葡萄霜霉病菌在葡萄葉部潛育期的量，接種6 h后就可以檢測(cè)到葡萄霜霉病菌DNA（圖8-A），通過Ct值在標(biāo)準(zhǔn)方程中換算得到葡萄霜霉病菌DNA的拷貝數(shù)（表2），接種48 h內(nèi)葉中潛伏的病原菌量變化不顯著，而到72、96 h時(shí)顯著高于48 h。潛伏侵染顯癥前葡萄霜霉病菌DNA量隨接種時(shí)間呈指數(shù)增長(zhǎng)（圖8-B），可用如下方程表示：y=6.34×104·e0.084x（R2=0.936），其中y為葡萄葉片內(nèi)葡萄霜霉病菌DNA量的拷貝數(shù)，x為接種后小時(shí)數(shù)。

表2 潛伏侵染葉片中葡萄霜霉病菌的real-time PCR定量測(cè)定Table 2 Quantitative determination of P. viticola in latent infected leaves by real-time PCR

3 討論

葡萄霜霉病是典型的單年流行病害，在田間潛育期短，發(fā)病快[4,25］，建立潛伏侵染階段的病原菌監(jiān)測(cè)與定量方法對(duì)早期準(zhǔn)確估計(jì)田間病情、確定發(fā)病中心并制定及時(shí)有效的防治方案具有重要意義[26-28］。目前有關(guān)葡萄霜霉病菌的real-time PCR檢測(cè)體系和早期分子診斷的方法報(bào)道較少。本研究基于葡萄霜霉病菌cox2設(shè)計(jì)了特異性引物F-cox-Pv/R-Pv，該引物對(duì)葡萄霜霉病菌具有較高的特異性，real-time PCR熔解曲線在79℃有唯一的產(chǎn)物吸收峰，靈敏性達(dá)到0.1 pg·μL-1，是常規(guī)PCR的100倍。陳長(zhǎng)軍等[29］建立的油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）real-time PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)值為 1.4×10-3ng·μL-1，靈敏度是常規(guī) PCR的10—100倍；程穎超等[30］根據(jù)辣椒疫霉Actin構(gòu)建的 real-time PCR 體系靈敏度為 0.1 pg·μL-1，為常規(guī)PCR靈敏度的100倍；秦文韜[31］利用LAMP技術(shù)對(duì)葡萄霜霉病菌進(jìn)行了擴(kuò)增，其靈敏度也是常規(guī) PCR的100倍，但與real-time PCR相比，LAMP引物設(shè)計(jì)較為繁瑣[32］，成本高，準(zhǔn)確性差，易產(chǎn)生假陽(yáng)性[33］，若無(wú)特殊儀器（如渾濁儀）無(wú)法進(jìn)行定量分析。而real-time PCR由于操作簡(jiǎn)單，特異性高，擴(kuò)增過程通過收集熒光信號(hào)可實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)的全過程，反應(yīng)靈敏，是進(jìn)行定量研究最為常用的技術(shù)之一，在植物病原的早期診斷和定量檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。

圖8 葡萄霜霉病菌葉部潛育期的檢測(cè)（A）及其動(dòng)態(tài)模擬（B）Fig. 8 Detection of leaf latent period of P. viticola (A) and its dynamic simulation (B)

Real-time PCR與常規(guī)PCR相比對(duì)引物特異性和擴(kuò)增片段大小的要求更高，引物擴(kuò)增片段大小一般為100—300 bp[19,29-30］。擴(kuò)增片段過長(zhǎng)，增加了非特異性擴(kuò)增的概率，熔解曲線表現(xiàn)為多吸收峰[18,34］。本試驗(yàn)選擇的引物擴(kuò)增片段大小符合 real-time PCR擴(kuò)增要求，為139 bp，且對(duì)葡萄霜霉病菌特異性高。在優(yōu)化葡萄霜霉病菌real-time PCR檢測(cè)體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，太低的退火溫度，擴(kuò)增反應(yīng)出現(xiàn)更大的Ct值、更小的熒光信號(hào)值，這可能與低的退火溫度產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增有關(guān)[29,35］。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系溫度升高至95℃后迅速降溫至60℃，有利于熔解曲線階段捕獲穩(wěn)定的熒光信號(hào)，獲得更好的產(chǎn)物吸收峰[18,36］，這可能與高溫減少引物二聚體的含量，降低其對(duì)熒光信號(hào)的干擾有關(guān)。

目前，利用real-time PCR方法對(duì)病原菌潛伏侵染的定量分析多集中于禾谷類作物病害的研究，而對(duì)于葡萄霜霉病菌的潛伏侵染定量研究報(bào)道較少。陳清清等[36］利用SYBR Green I real-time PCR定量檢測(cè)索氏平臍蠕孢（Bipolaris sorokinianaa）引起的小麥根腐病，可以檢測(cè)出田間小麥樣品中52.8 fg·μL-1的病菌DNA；潘娟娟等[37］利用real-time PCR方法檢測(cè)到接種12 h后小麥條銹病菌（P. striiformis）的DNA含量，潛育期病原菌量檢測(cè)范圍為100 fg—10 ng。本研究構(gòu)建的葡萄霜霉病菌real-time PCR體系具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9968），范圍為 2.4×103—2.4×109copies/μL，擴(kuò)增效率為 98.50%，重復(fù)性較好，可定量檢測(cè)低至5.68×104copies/μL的葉片內(nèi)葡萄霜霉病菌潛伏侵染量，達(dá)到病害早期預(yù)警的病原檢測(cè)要求[30,35,37］。利用該體系定量檢測(cè)葡萄霜霉病菌在葡萄葉片潛育期病原菌的DNA量，能檢測(cè)到病原菌侵入葉片6 h后的低侵染量，這為葡萄霜霉病的早期診斷與預(yù)測(cè)提供了技術(shù)支持。

處于潛育期的葡萄霜霉病葉片不表現(xiàn)癥狀，葉片內(nèi)病原菌含量太低，采用傳統(tǒng)的生物學(xué)檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，待顯癥后已造成損失，為病害的預(yù)測(cè)和防控帶來(lái)困難。金恭璽等[7］曾采用病部研磨-過篩-離心-鏡檢的方法證明葡萄霜霉病菌卵孢子在病殘?bào)w上越冬；于舒怡等[8,25］采用田間捕獲孢子囊的方法探討了孢子囊密度與葡萄霜霉病始發(fā)期、田間病害發(fā)生程度以及氣候條件的相關(guān)性，這些傳統(tǒng)的葡萄霜霉病菌檢測(cè)方法手段繁瑣、無(wú)法進(jìn)行早期的病害預(yù)測(cè)。目前，根據(jù)真菌 ITS、β-tublin以及cox2等保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物，利用real-time PCR方法定量研究如種子[38］、葉片[37,39-40］、土壤[19,21,36］中潛伏侵染的病原菌，確定了病原菌 DNA拷貝數(shù)與接種量及病情指數(shù)的相關(guān)性，可為病害的早期預(yù)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和防治決策提供理論依據(jù)[35-37］。本研究建立的葡萄霜霉病菌real-time PCR體系和病原潛伏侵染量的檢測(cè)方法，對(duì)預(yù)測(cè)葡萄霜霉病始發(fā)期的意義更大，結(jié)合田間微環(huán)境條件確定田間發(fā)病中心，從而及時(shí)有效地控制病害的發(fā)生和蔓延。

4 結(jié)論

將real-time PCR技術(shù)應(yīng)用于葡萄霜霉病菌的快速檢測(cè)，顯著提高了病菌檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)可對(duì)葡萄霜霉病菌潛育期葉片的病原量進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。通過定量檢測(cè)潛育期葉片中病原菌量，結(jié)合田間微氣候、寄主植物感病程度等條件預(yù)測(cè)田間病害的始發(fā)期，可及時(shí)有效地防控葡萄霜霉病的發(fā)生，在葡萄生產(chǎn)上具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。