李文學，肖瑞剛，呂苗苗，丁寧，石華榮，顧沛雯

（1寧夏大學農學院，銀川 750021；2寧夏大學葡萄酒學院，銀川 750021）

0 引言

【研究意義】由葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）引起的葡萄霜霉病遍及世界各葡萄產區(qū)，是危害最嚴重的葡萄葉部病害之一[1］。一般年份葡萄霜霉病導致的葡萄減產約為 10%—20%，葡萄霜霉病流行年份可達 50%—80%，甚至絕產，嚴重制約葡萄產業(yè)的發(fā)展[2-3］。葡萄霜霉病是一種典型的流行性病害[4］，病菌從侵入到發(fā)病需要 3—5 d[5］。在條件適宜時，從田間出現(xiàn)中心病株到全田普發(fā)，僅需10—15 d[6］。葡萄霜霉病菌是營活體營養(yǎng)專性寄生的真菌，目前人工無法培養(yǎng)，在一定程度上制約了葡萄霜霉病菌的早期診斷[7］、監(jiān)測[4,8］和群體遺傳分化[9-10］等方面的研究。尤其在病害潛伏侵染期間，傳統(tǒng)的檢測鑒定時間長，給該病害的防控工作帶來極大的困難。因此，建立葡萄霜霉病早期的快速、便捷、定量的檢測技術對于指導該病害防控工作具有重要意義。【前人研究進展】葡萄霜霉病菌的檢測方面，傳統(tǒng)的方法是保濕培養(yǎng)、活體接種純化菌株、顯微觀察和形態(tài)鑒定[11-12］，其程序繁瑣、周期長，且無法定量研究[7,13］。隨著生物技術的發(fā)展，近年來多種分子檢測手段廣泛應用于病原菌的檢測和定量研究，如常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，real-time PCR）和環(huán)介導等溫擴增技術（loopmediated isothermal amplification method，LAMP）。李榮[14］利用真菌的rDNA-ITS、β-tubulin和Cyt b基因序列研究了葡萄霜霉病菌菌株的遺傳變異，得出Cyt b基因序列的辨析度最高，分類效果最清晰；秦文韜等[15］根據葡萄霜霉病菌細胞色素 c氧化酶亞型 2（cytochrome c oxidase II，cox2）基因設計特異性引物，檢測了 78份來自國內不同葡萄產區(qū)的葡萄霜霉病菌樣本，準確率達100%。Real-time PCR是美國應用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems，ABI）公司推出的通過檢測熒光信號的變化進行核酸定量的技術[16］，主要應用于分子快速檢測和定量研究。隨著該技術在植物病害診斷和防控工作中的快速發(fā)展，在指導生產中發(fā)揮了重要作用。ZHENG等[17］構建了定量檢測小麥白粉病菌（Blumeria graminisf. sp. tritici）在葉片中潛伏侵染量的real-time PCR方法，通過人工和自然接種的方式進行田間小麥白粉病菌的早期監(jiān)測，指導小麥白粉病的早期預測與防控；孫炳劍等[18］建立了基于小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）β-tubilin的SYBR Green I real-time PCR體系，確定了病原菌DNA拷貝數與接種量及病情指數的相關關系；賀字典等[19］構建了定量檢測土壤中棘孢木霉（Trichoderma asperellum）定殖的real-time PCR方法，并對防治黃瓜枯萎病后該生防木霉菌數量在土壤中的動態(tài)變化進行了檢測；DUVIVIER等[20］利用real-time PCR技術研究小麥葉銹病的流行學，定量檢測了孢子捕捉器捕獲的空中小麥葉銹菌（Puccinia triticina）夏孢子量，探討空中夏孢子量與病害嚴重度之間的關系；謝學文等[21］構建了短密木霉（Trichoderma brevicompactum）的real-time PCR體系，示蹤短密木霉對辣椒疫霉（Phytophthora capsici）在南瓜根際土中的動態(tài)變化，揭示根際微生物的拮抗過程。在霜霉病菌的定量研究方面，VALSESIA等[22］利用探針法對葉片中的葡萄霜霉病菌進行了相對定量研究；LEE等[23］建立了定量檢測黃瓜葉部古巴假霜霉（Pseudoperonospora cubensis）的real-time PCR方法；張娜等[24］構建了基于甜菜霜霉病菌（Peronospora farinosa）cox2的 SYBR Green Ⅰreal-time PCR方法，該體系檢測靈敏度為100 fg病菌DNA。【本研究切入點】在前人定性檢測葡萄霜霉病菌的研究基礎上，根據葡萄霜霉病菌cox2基因序列設計特異性引物，構建real-time PCR分子檢測體系；通過人工接種的方法，研究潛育期葡萄葉片菌含量與接種時間的關系。【擬解決的關鍵問題】構建快捷、準確和定量檢測葡萄霜霉病菌的real-time PCR方法，分析葡萄霜霉病菌在葡萄葉部潛育期菌含量的動態(tài)變化，建立相關模型，為田間葡萄霜霉病早期預測、風險評估和防治決策提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2017年6月至2018年10月在寧夏大學植物病理實驗室和寧夏葡萄與葡萄酒研究院生理實驗室完成。

1.1 主要儀器和試劑

qTOWER 2.2熒光定量PCR儀（Jena公司，德國）；Azure c200凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems公司，美國）；Simpli Nano超微量分光光度計（GE公司，美國）；電泳儀（北京六一廠）；真菌 DNA提取試劑盒（Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit，BioFlux公司，日本）；植物DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?HP Plant DNA Mini Kit，Omega Bio-tek公司，美國）；膠純化試劑盒（Universal DNA Purification Kit，天根生化公司）；質粒DNA小量試劑盒（AxyPrep?Plasmid Miniprep Kit，CORNING公司，美國）；EcoTaq?PCR SuperMix（+dye）、TransStart?Tip Green qPCR SuperMix（全式金公司）。

1.2 材料

14種葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌包括葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫蘆白粉病菌（Sphaerothecafuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、馬鈴薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（表 1）。其中馬鈴薯干腐病菌、西瓜枯萎病菌和哈茨木霉由寧夏農林科學院植物保護研究所沈瑞清研究員提供，其他菌株由寧夏大學農學院植物病理實驗室純化保存。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA的提取 稱取0.5 g葡萄葉片，利用E.Z.N.A.?HP Plant DNA Kit（OMEGA 公司）提取葡萄葉片總DNA；稱取真菌菌絲體 0.1 g，用Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux 公司）提取真菌菌絲體DNA。超微量分光光度計檢測DNA濃度及OD值，DNA濃度均稀釋至200 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設計與合成 使用Primer Premier 5.0，根據 GenBank中葡萄霜霉病菌的cox2基因序列（登錄號：HM628756.1、KC774622.1、KJ654170.1、KP684908.1、KT944077.1等）設計2對引物F-Pv（5′-CA AGATCCAGCAACTCCAGTTATGGA-3′）/R-Pv（5′-ACATTGTCCATAAAAAACACCTTGT-3′）和 F-cox-Pv（5′-TCGTGTATTGATTACTGCGTCAAA-3′）/R-Pv，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.3 引物特異性檢查 對提取的上述（表 1）13種葡萄、白菜、辣椒、甘草、西葫蘆、番茄、馬鈴薯、西瓜上的病原菌和1種拮抗菌（T. harzianum）的DNA，以 ddH2O為空白對照，用引物對 F-Pv/R-Pv和F-cox-Pv/R-Pv進行常規(guī)PCR和real-time PCR擴增，檢測引物特異性。

表1 供試菌株Table 1 Tested strains

常規(guī)PCR反應體系（25 μL）：2×EcoTaq?PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足。反應條件：94℃預變性10 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃ ∞。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

Real-time PCR反應體系（20 μL）：以SYBR Green Ⅰ為熒光染料，進行real-time PCR反應。2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，正反引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，模板 DNA 1.0 μL，ddH2O補足。Real-time PCR反應條件（三步法）：94℃預變性30 s；94℃變性5 s，59℃退火15 s，72℃延伸30 s（收集熒光信號），40個循環(huán)。PCR循環(huán)結束后，加熱至 95℃后降至 60℃并保持 15 s，然后按照 5℃·s?1升溫至 95℃，在升溫時每 0.5℃收集熒光信號一次，建立熔解曲線，熔解曲線分析中有單一特異的峰為判斷引物特異性的標準。

1.3.4 優(yōu)化 real-time PCR反應退火溫度 為提升real-time PCR反應擴增特異性，優(yōu)化退火溫度（annealing temperature，Tm）。按1.3.3 real-time PCR反應體系及條件，以擴增曲線和熔解曲線熒光值（ΔRn）最高、循環(huán)閾值（每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán)數，cycle threshold，Ct）最小且在熔解曲線分析中有單一吸收峰為標準，進行最佳退火溫度的優(yōu)化。

1.3.5 靈敏度檢測 基因組DNA經超微量分光光度計測定濃度后按 10倍稀釋，分別釆用常規(guī) PCR和real-time PCR的擴增方法進行PCR檢測，根據擴增片段的有無和熒光值的大小，評價引物在兩種PCR技術下對葡萄霜霉病菌DNA檢測的靈敏度。

1.3.6 重組質粒的制備 葡萄霜霉病菌特異性引物F-cox-Pv/R-Pv擴增產物經純化后，與pEASY?-T1 Simple Cloning Vector于25℃連接后，轉至Trans1-T1感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單克隆，轉于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。提取重組質粒，使用PCR驗證和測序（生工生物工程（上海）有限公司）的方法檢測是否正確插入目的片段。超微量分光光度計測定質粒DNA濃度和純度，根據摩爾定律，計算單位體積質粒所含的DNA拷貝數濃度。

質?？截悢?[質粒濃度（ng·μL-1）×質粒體積（μL）×6.02×1023］/[（載體長度bp+片段長度bp）×660 g·mol-1］

1.3.7 Real-time PCR標準曲線繪制及方法有效性檢驗 將定量后的高拷貝數重組質粒按 10倍梯度進行稀釋，作為標準品。用引物 F-cox-Pv/R-Pv進行real-time PCR檢測，選擇熒光值穩(wěn)定且線性比例良好的濃度范圍，以拷貝數對數值為x軸、Ct值為y軸，構建real-time PCR標準曲線（由軟件real-time PCR soft 3.2生成）。根據real-time PCR標準曲線的相關系數、斜率、PCR擴增效率等，驗證該方法的有效性。其中，相關系數R2＞0.98；曲線斜率為-3.0—-3.5；PCR擴增效率（E）為0.9—1.2；標準偏差＜0.2；real-time PCR 擴增效率 E＝10(-1/斜率)-1。

1.3.8 Real-time PCR定量檢測接種后葉片中病原菌含量 選用在? MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，根系達到4—5根的赤霞珠葡萄無菌組培苗，摘取大小相似的葉片進行接種試驗。葡萄霜霉病菌來源于田間發(fā)病初期的葡萄葉片，取回后無菌水沖洗表面灰塵，氣候培養(yǎng)箱中 24℃、相對濕度 95%的黑暗條件下進行保濕培養(yǎng)，至葉背密集長出新的霉層，選取霉層厚度一致的部位，用1.5 cm打孔器打取病斑葉盤，將葉盤霉層直接與無菌組培苗葉背拓貼接菌，一葉一盤。在氣候培養(yǎng)箱中24℃、相對濕度95%的黑暗條件下保濕培養(yǎng)6 h，去掉葉盤，共接種葡萄葉片30片，以空白無菌組培苗葉片為對照；在氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6、12、24、48、72和96 h（接種96 h后葉片出現(xiàn)霉層）收集接種葉片，每處理重復3次。將葡萄葉片無菌水清洗，剪碎，混勻，稱取0.5 g，按照1.3.1的方法提取葡萄葉片總DNA。用引物F-cox-Pv/R-Pv進行real-time PCR擴增，應用已構建的標準曲線計算潛育期葉片中葡萄霜霉病菌的帶菌量（反應體系和條件同1.3.3），建立接種葉片內霜霉病菌DNA量隨時間變化的定量關系。

1.4 數據處理

采用統(tǒng)計軟件 IBM SPSS Statistics 19.0的Regression-Curve Estimation程序進行曲線模擬。

2 結果

2.1 引物特異性驗證

應用引物F-Pv/R-Pv和F-cox-Pv/R-Pv對葡萄霜霉病菌、12株植物病原菌和1株拮抗菌（表1）的DNA進行常規(guī)PCR擴增，結果顯示僅葡萄霜霉病菌DNA擴增出570和139 bp的目標條帶，而其他供試菌DNA和清水對照等均未擴增出條帶（圖1）。應用引物F-cox-Pv/Pv-R進行real-time PCR擴增，結果表明該引物僅對葡萄霜霉病菌有唯一的產物吸收峰（圖2）。

圖1 引物F-Pv/R-Pv（A）和F-cox-Pv/R-Pv（B）特異性檢測Fig. 1 Specificity detection of P. viticola primers F-Pv/R-Pv (A) and F-cox-Pv/ R-Pv (B) by using genomic DNA with conventional PCR

圖2 Real-time PCR熔解曲線Fig. 2 Melting curves of real-time PCR amplification

2.2 引物靈敏度檢測

利用 10倍濃度梯度稀釋的基因組 DNA對引物F-Pv/R-Pv和F-cox-Pv/R-Pv進行常規(guī)PCR靈敏度測定，結果表明常規(guī) PCR的檢測靈敏度為1.0×10-2ng·μL-1（圖 3）；Real-time PCR 技術利用引物對F-cox-Pv/R-Pv的檢測靈敏度為1.0×10-4ng·μL-1（圖 4），是常規(guī) PCR檢測靈敏度的 100倍。

圖3 引物F-Pv/R-Pv（A）和F-cox-Pv/R-Pv（B）常規(guī)PCR靈敏度檢測Fig. 3 Sensitivity detection of P. viticola primers F-Pv/R-Pv (A) and F-cox-Pv/R-Pv (B) by using series genomic DNA dilutions with conventional PCR

圖4 Real-time PCR檢測引物靈敏度Fig. 4 Sensitivity detection of P. viticola primers with real-time PCR

2.3 Real-time PCR反應退火溫度的優(yōu)化

優(yōu)化real-time PCR反應退火溫度（Tm），提升反應擴增特異性。以引物對F-cox-Pv/R-Pv常規(guī)PCR最優(yōu)Tm值57℃為基礎，采用線性±1℃篩選最優(yōu)Tm值（圖5）。結果表明引物對F-cox-Pv/R-Pv在 59℃時獲得最小Ct值（圖5-A）和最高熒光強度（圖5-A、5-B），為最優(yōu) Tm值，因此選擇59℃作為葡萄霜霉病菌real-time PCR反應的Tm值。

圖5 Real-time PCR反應Tm值的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of Tm value of real-time PCR assays

2.4 Real-time PCR標準曲線的建立及方法有效性檢驗

2.4.1 重組質粒的制備 成功將目的片段插入到pEASY?-T1 Simple克隆載體，常規(guī)PCR檢測插入的片段大小約140 bp（圖6），與測序結果139 bp一致；提取的重組質粒濃度和純度（A260/A280=1.874）均較高，重組質粒的制備符合試驗要求。

2.4.2 標準曲線的建立及方法有效性檢驗 重組質粒以10倍梯度稀釋制備標準品進行real-time PCR檢測，引物F-cox-Pv/R-Pv的擴增對數曲線規(guī)律較好（圖7-A）；以不同稀釋梯度的質?？截悢祵禐閤軸、Ct值為y軸構建標準曲線（圖7-B），該體系線性關系良好（y=42.27-3.36x），相關系數R2=0.9968，斜率為-3.36，截距為42.27，擴增效率為98.50%，線性范圍達7個數量級（2.4×103—2.4×109copies/μL）。

圖6 重組質粒的構建Fig. 6 Construction of recombinant plasmid

圖7 Real-time PCR標準曲線的建立Fig. 7 Establishment of real-time PCR standard curve

2.5 潛伏侵染葉片中病原菌的real-time PCR定量測定

應用構建的real-time PCR體系測定葡萄霜霉病菌在葡萄葉部潛育期的量，接種6 h后就可以檢測到葡萄霜霉病菌DNA（圖8-A），通過Ct值在標準方程中換算得到葡萄霜霉病菌DNA的拷貝數（表2），接種48 h內葉中潛伏的病原菌量變化不顯著，而到72、96 h時顯著高于48 h。潛伏侵染顯癥前葡萄霜霉病菌DNA量隨接種時間呈指數增長（圖8-B），可用如下方程表示：y=6.34×104·e0.084x（R2=0.936），其中y為葡萄葉片內葡萄霜霉病菌DNA量的拷貝數，x為接種后小時數。

表2 潛伏侵染葉片中葡萄霜霉病菌的real-time PCR定量測定Table 2 Quantitative determination of P. viticola in latent infected leaves by real-time PCR

3 討論

葡萄霜霉病是典型的單年流行病害，在田間潛育期短，發(fā)病快[4,25］，建立潛伏侵染階段的病原菌監(jiān)測與定量方法對早期準確估計田間病情、確定發(fā)病中心并制定及時有效的防治方案具有重要意義[26-28］。目前有關葡萄霜霉病菌的real-time PCR檢測體系和早期分子診斷的方法報道較少。本研究基于葡萄霜霉病菌cox2設計了特異性引物F-cox-Pv/R-Pv，該引物對葡萄霜霉病菌具有較高的特異性，real-time PCR熔解曲線在79℃有唯一的產物吸收峰，靈敏性達到0.1 pg·μL-1，是常規(guī)PCR的100倍。陳長軍等[29］建立的油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）real-time PCR檢測方法，最低檢測值為 1.4×10-3ng·μL-1，靈敏度是常規(guī) PCR的10—100倍；程穎超等[30］根據辣椒疫霉Actin構建的 real-time PCR 體系靈敏度為 0.1 pg·μL-1，為常規(guī)PCR靈敏度的100倍；秦文韜[31］利用LAMP技術對葡萄霜霉病菌進行了擴增，其靈敏度也是常規(guī) PCR的100倍，但與real-time PCR相比，LAMP引物設計較為繁瑣[32］，成本高，準確性差，易產生假陽性[33］，若無特殊儀器（如渾濁儀）無法進行定量分析。而real-time PCR由于操作簡單，特異性高，擴增過程通過收集熒光信號可實時觀察反應的全過程，反應靈敏，是進行定量研究最為常用的技術之一，在植物病原的早期診斷和定量檢測中發(fā)揮著重要的作用。

圖8 葡萄霜霉病菌葉部潛育期的檢測（A）及其動態(tài)模擬（B）Fig. 8 Detection of leaf latent period of P. viticola (A) and its dynamic simulation (B)

Real-time PCR與常規(guī)PCR相比對引物特異性和擴增片段大小的要求更高，引物擴增片段大小一般為100—300 bp[19,29-30］。擴增片段過長，增加了非特異性擴增的概率，熔解曲線表現(xiàn)為多吸收峰[18,34］。本試驗選擇的引物擴增片段大小符合 real-time PCR擴增要求，為139 bp，且對葡萄霜霉病菌特異性高。在優(yōu)化葡萄霜霉病菌real-time PCR檢測體系時發(fā)現(xiàn)，太低的退火溫度，擴增反應出現(xiàn)更大的Ct值、更小的熒光信號值，這可能與低的退火溫度產生非特異性擴增有關[29,35］。擴增反應結束后，將反應體系溫度升高至95℃后迅速降溫至60℃，有利于熔解曲線階段捕獲穩(wěn)定的熒光信號，獲得更好的產物吸收峰[18,36］，這可能與高溫減少引物二聚體的含量，降低其對熒光信號的干擾有關。

目前，利用real-time PCR方法對病原菌潛伏侵染的定量分析多集中于禾谷類作物病害的研究，而對于葡萄霜霉病菌的潛伏侵染定量研究報道較少。陳清清等[36］利用SYBR Green I real-time PCR定量檢測索氏平臍蠕孢（Bipolaris sorokinianaa）引起的小麥根腐病，可以檢測出田間小麥樣品中52.8 fg·μL-1的病菌DNA；潘娟娟等[37］利用real-time PCR方法檢測到接種12 h后小麥條銹病菌（P. striiformis）的DNA含量，潛育期病原菌量檢測范圍為100 fg—10 ng。本研究構建的葡萄霜霉病菌real-time PCR體系具有良好的線性關系（R2=0.9968），范圍為 2.4×103—2.4×109copies/μL，擴增效率為 98.50%，重復性較好，可定量檢測低至5.68×104copies/μL的葉片內葡萄霜霉病菌潛伏侵染量，達到病害早期預警的病原檢測要求[30,35,37］。利用該體系定量檢測葡萄霜霉病菌在葡萄葉片潛育期病原菌的DNA量，能檢測到病原菌侵入葉片6 h后的低侵染量，這為葡萄霜霉病的早期診斷與預測提供了技術支持。

處于潛育期的葡萄霜霉病葉片不表現(xiàn)癥狀，葉片內病原菌含量太低，采用傳統(tǒng)的生物學檢測方法耗時較長，待顯癥后已造成損失，為病害的預測和防控帶來困難。金恭璽等[7］曾采用病部研磨-過篩-離心-鏡檢的方法證明葡萄霜霉病菌卵孢子在病殘體上越冬；于舒怡等[8,25］采用田間捕獲孢子囊的方法探討了孢子囊密度與葡萄霜霉病始發(fā)期、田間病害發(fā)生程度以及氣候條件的相關性，這些傳統(tǒng)的葡萄霜霉病菌檢測方法手段繁瑣、無法進行早期的病害預測。目前，根據真菌 ITS、β-tublin以及cox2等保守序列設計的特異性引物，利用real-time PCR方法定量研究如種子[38］、葉片[37,39-40］、土壤[19,21,36］中潛伏侵染的病原菌，確定了病原菌 DNA拷貝數與接種量及病情指數的相關性，可為病害的早期預測、風險評估和防治決策提供理論依據[35-37］。本研究建立的葡萄霜霉病菌real-time PCR體系和病原潛伏侵染量的檢測方法，對預測葡萄霜霉病始發(fā)期的意義更大，結合田間微環(huán)境條件確定田間發(fā)病中心，從而及時有效地控制病害的發(fā)生和蔓延。

4 結論

將real-time PCR技術應用于葡萄霜霉病菌的快速檢測，顯著提高了病菌檢測的靈敏度，同時可對葡萄霜霉病菌潛育期葉片的病原量進行準確的定量檢測。通過定量檢測潛育期葉片中病原菌量，結合田間微氣候、寄主植物感病程度等條件預測田間病害的始發(fā)期，可及時有效地防控葡萄霜霉病的發(fā)生，在葡萄生產上具有重要的理論和實際應用價值。