戎國(guó)棟 趙鴻 吳蕾 黃珮珺 王芳 張燕 徐婷

近年來，隨著磁珠分離技術(shù)在病毒核酸檢測(cè)領(lǐng)域的普及應(yīng)用，很多公司推出了全自動(dòng)核酸提取儀［1］。此類儀器利用磁珠法進(jìn)行核酸提取純化，提高了核酸提取的效率，降低人工操作誤差，實(shí)現(xiàn)了病毒核酸的高敏高通量檢測(cè)，在臨床分子檢驗(yàn)中得到了廣泛關(guān)注［2-3］，但其檢測(cè)性能尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。由于乙型肝炎病毒核酸（hepatitis B virus DNA，HBV-DNA）檢測(cè)為臨床分子實(shí)驗(yàn)室最常見的檢測(cè)項(xiàng)目，本文以HBV-DNA 定量檢測(cè)為例，通過對(duì)6 套全自動(dòng)核酸提取儀的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性相關(guān)性、檢測(cè)下限、防污染能力和開放能力的臨床驗(yàn)證，旨在建立適用于全自動(dòng)核酸提取儀臨床選擇和評(píng)價(jià)的驗(yàn)證方案，為實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)HBV-DNA 定量檢測(cè)全自動(dòng)化流程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品準(zhǔn)備

采用陰性血清將106IU/mL 濃度水平的乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司）稀釋至1×104IU/mL、1×103IU/mL、1×102IU/mL、5×101IU/mL、2×101IU/mL和1×101IU/mL，分別編號(hào)為A、B、C、D、E 和F，每個(gè)濃度梯度若干管，1 mL/管分裝，-70℃凍存。

1.1.2 儀器與試劑

6 個(gè)國(guó)內(nèi)外主流品牌全自動(dòng)核酸提取儀，采用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ThermoFisher，美國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增，COBAS Ampliprep & Taqman 48 系統(tǒng)（Roche，瑞士）作為定量參考。檢測(cè)試劑為各廠商配套的乙型肝炎病毒核酸提取和擴(kuò)增試劑盒。系統(tǒng)開放性評(píng)價(jià)中采用上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2 方法

1.2.1 防污染能力

HBV-DNA 定量結(jié)果為107IU/mL 濃度水平的臨床血清樣品若干份混合，分裝；HBV-DNA 檢測(cè)陰性樣本混合，分裝。在全自動(dòng)提取儀中以陰陽(yáng)相間的方式排列，用6 個(gè)品牌全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)提取HBV-DNA，熒光定量PCR 檢測(cè)，觀察其防污染能力。

1.2.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

采用羅氏COBAS Ampliprep & Taqman 48 系統(tǒng)及6 個(gè)品牌全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)對(duì)樣品A-F 進(jìn)行HBV-DNA 定量檢測(cè)，每個(gè)濃度梯度重復(fù)檢測(cè)2 次，取均值。通過比較各品牌儀器在對(duì)應(yīng)濃度檢測(cè)結(jié)果的偏倚（待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果平均數(shù)的對(duì)數(shù)值-羅氏結(jié)果平均數(shù)的對(duì)數(shù)值）對(duì)準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

A（1×104IU/mL）與C（1×102IU/mL）2 個(gè)濃度梯度的樣品平行提取5 次后，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，通過極差（5 次結(jié)果中最高值的對(duì)數(shù)值-最低值的對(duì)數(shù)值）評(píng)價(jià)各儀器重復(fù)性。

1.2.4 檢測(cè)下限

分析各品牌儀器所能檢測(cè)出的最低檢測(cè)濃度并計(jì)算檢出率。

1.2.5 線性相關(guān)性

以羅氏測(cè)定值為X，各品牌檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定值為Y，對(duì)樣品A-F 共6 個(gè)濃度梯度檢測(cè)結(jié)果計(jì)算線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)R2。

1.2.6 開放性試驗(yàn)

采用第三方HBV-DNA 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒，ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，對(duì)各品牌儀器提取的樣品A-F 的模板進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、檢測(cè)下限以及線性相關(guān)性，并與配套檢測(cè)系統(tǒng)比較。

2 結(jié)果

2.1 防污染能力

檢測(cè)結(jié)果顯示，5 種品牌儀器的高濃度陽(yáng)性樣本均檢出，陰性標(biāo)本均未檢出，防污染性能高。僅有一個(gè)品牌儀器陰性標(biāo)本均呈現(xiàn)低濃度檢出，平均Ct 值為30.56，平均檢測(cè)值為6.04×101IU/mL，防污染測(cè)試未通過，停止后續(xù)驗(yàn)證。

2.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

檢測(cè)結(jié)果與羅氏結(jié)果的對(duì)數(shù)值差值位于±0.4之間時(shí)，準(zhǔn)確性較高。配套系統(tǒng)中品牌一和品牌四準(zhǔn)確性較高（表1），開放性系統(tǒng)中品牌一的準(zhǔn)確性最高（表2）。

表1 5 種品牌儀器配套系統(tǒng)的準(zhǔn)確性結(jié)果（偏倚，log）Table 1 Accuracy results of 5 instruments with matching systems（Bias，log）

表2 5 種品牌儀器開放性系統(tǒng)的準(zhǔn)確性結(jié)果（偏倚，log）Table 2 Accuracy results of 5 instruments with open systems（Bias，log）

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

A（1×104IU/mL）與C（1×102IU/mL）2 個(gè)濃度的樣品分別用配套系統(tǒng)和開放性系統(tǒng)平行提取5 次后，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，其5 次結(jié)果的極差如表3所示。配套系統(tǒng)測(cè)試中，品牌一、品牌二的重復(fù)性結(jié)果相當(dāng)；但在開放性系統(tǒng)中，品牌一的重復(fù)性顯著優(yōu)于其他品牌。

表3 5 種品牌儀器的重復(fù)性結(jié)果（極差，log）Table 3 Repeatability results for 5 instruments（Range，log）

2.4 檢測(cè)下限

低值樣品E（2×101IU/mL）和F（1×101IU/mL）的檢出率如表4所示，樣品A-D 在各品牌儀器中的檢出率均為100%。配套系統(tǒng)中，品牌一和品牌五對(duì)低值樣品檢出率較高，而開放性系統(tǒng)中品牌一低值樣品檢出率最佳。

表4 5 種品牌儀器的檢測(cè)下限Table 4 Limit of detection for 5 instruments

2.5 線性相關(guān)性

線性范圍以羅氏值為X，實(shí)際測(cè)定值為Y，在101～104IU/mL 范圍內(nèi)，自動(dòng)核酸提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增方法線性范圍內(nèi)均良好。配套系統(tǒng)中，品牌一至品牌五的線性相關(guān)性R2分別為0.980、0.992、0.998、0.990、0.964，其中品牌三線性相關(guān)性系數(shù)最佳，見圖1。開放性系統(tǒng)中，品牌一至品牌五的線性相關(guān)性R2分別為0.991、0.977、0.976、0.920、0.974，其中品牌一線性相關(guān)性系數(shù)最佳，見圖2。

圖1 配套系統(tǒng)，品牌三與羅氏檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性Figure 1 Matching system，linear correlation between Brand 3 and Roche system

圖2 開放性系統(tǒng)，品牌一與羅氏檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)性Figure 2 Open system，linear correlation between Brand 1 and Roche system

2.6 開放性試驗(yàn)

由上述結(jié)果可見，系統(tǒng)開放性評(píng)價(jià)中，采用第三方擴(kuò)增試劑檢測(cè)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和檢測(cè)下限普遍低于配套檢測(cè)系統(tǒng)，其中品牌一在各檢測(cè)參數(shù)中均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，開放性最佳。

3 討論

近年來，核酸檢測(cè)已成為臨床分子實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用研究手段之一，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。因此，核酸提取成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸提取技術(shù)也從最初的手工提取發(fā)展到全自動(dòng)核酸提取，同時(shí)解決了傳統(tǒng)手工法操作復(fù)雜、重復(fù)性差、通量低等問題。目前，市場(chǎng)上的全自動(dòng)核酸提取儀品牌繁多，性能參差不齊。根據(jù)CNAS-CL02：《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）及CNAS-CL36：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》［4-5］要求，臨床實(shí)驗(yàn)室在引入新的檢測(cè)方法或檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，需驗(yàn)證其在本實(shí)驗(yàn)室能否達(dá)到廠家聲明的性能［6］。因此，本研究從準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性相關(guān)性、檢測(cè)下限、防污染能力和開放能力6個(gè)方面對(duì)目前市場(chǎng)上常見的6 款全自動(dòng)核酸提取儀的性能進(jìn)行了臨床驗(yàn)證，制定了全自動(dòng)核酸提取儀的性能驗(yàn)證方案，以期在眾多的儀器品牌中挑選出更適用于臨床分子檢測(cè)領(lǐng)域的儀器及為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)新檢測(cè)儀器的引入提供參考方案。

我國(guó)作為乙肝大國(guó)，HBV-DNA 檢測(cè)已成為臨床分子實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，因此本研究選擇HBV-DNA 為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)6 款全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行性能驗(yàn)證。對(duì)于全自動(dòng)核酸提取儀的性能驗(yàn)證，近年來陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道，但一次性對(duì)多款儀器及多指標(biāo)同步進(jìn)行性能驗(yàn)證的類似研究尚未有先例。本研究中通過儀器試劑配套實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明品牌一、四與羅氏結(jié)果偏倚最小，準(zhǔn)確性佳；羅氏定量檢測(cè)系統(tǒng)具有靈敏度、精確度和可重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，被國(guó)際公認(rèn)為HBV-DNA 定量檢測(cè)的參比試劑。本研究結(jié)果與李莉華等［7］在不同檢測(cè)系統(tǒng)中應(yīng)用國(guó)產(chǎn)核酸檢測(cè)試劑研究結(jié)果相符，這可能與不同試劑盒廠家采購(gòu)的原材料及生產(chǎn)水平差異相關(guān)。此外，本研究重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示品牌一、二對(duì)樣品A（1×104IU/mL）與C（1×102IU/mL）的檢測(cè)結(jié)果極差小，重復(fù)性佳；品牌一、五對(duì)樣品F（1×101IU/mL）的檢出率為100%，高于其他品牌；品牌三線性相關(guān)系數(shù)為0.998，均大于其他品牌，表明其與羅氏檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性最佳；而在開放性實(shí)驗(yàn)中，其準(zhǔn)確性、重復(fù)性和檢測(cè)下限均低于配套系統(tǒng)，但品牌一在各檢測(cè)參數(shù)中顯示了最佳的檢測(cè)性能。在已發(fā)表的文獻(xiàn)中，有從靈敏度、精密度［8］、檢出率、精密度、重復(fù)性分別對(duì)核酸提取儀進(jìn)行性能評(píng)價(jià)［9］的研究，還有對(duì)其臨床可行性進(jìn)行驗(yàn)證的研究［10］，這些研究結(jié)果都提示核酸提取儀具有操作簡(jiǎn)單、快速、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床檢驗(yàn)推廣，與本研究結(jié)果相符。但在已有的研究中并未有從橫向?qū)Χ嗥放苾x器之間差異的研究，在此基礎(chǔ)上本文對(duì)6 個(gè)品牌核酸提取儀進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)，其中儀器品牌涵蓋了主流進(jìn)口品牌與國(guó)產(chǎn)品牌，且本次研究中參與實(shí)驗(yàn)的研究人員跨省市開展實(shí)驗(yàn)、采集數(shù)據(jù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示開放性系統(tǒng)中品牌一為最優(yōu)提取儀，配套系統(tǒng)中每個(gè)品牌各有優(yōu)勢(shì)，可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不一樣的儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為臨床分子實(shí)驗(yàn)室對(duì)核酸提取儀的選擇和評(píng)價(jià)提供參考和指導(dǎo)。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)還在于，首次采用了第三方擴(kuò)增試劑盒評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)開放性，有利于擴(kuò)增試劑的多項(xiàng)選擇，對(duì)后續(xù)自建檢測(cè)項(xiàng)目的開展及科研應(yīng)用也具有一定意義。本研究已從橫向多指標(biāo)對(duì)多品牌核酸提取儀進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為了更全面、更完善地了解核酸提取系統(tǒng)的臨床檢測(cè)性能，后續(xù)研究可以增加對(duì)全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)的抗干擾能力（如溶血、脂血、黃疸等）［11］、對(duì)不同基因型HBV核酸檢測(cè)能力［12-13］等方面的研究進(jìn)一步評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用性能。

綜上所述，經(jīng)過本次性能評(píng)價(jià)，品牌一全自動(dòng)核酸提取儀在配套系統(tǒng)和開放性試驗(yàn)中均表現(xiàn)良好，顯著優(yōu)于其他品牌，與Roche 定量檢測(cè)系統(tǒng)在各指標(biāo)上無(wú)明顯差異，鑒于其明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，有利于臨床推廣應(yīng)用。本性能驗(yàn)證方案在全自動(dòng)核酸提取儀的臨床選擇和評(píng)價(jià)中有效可行。