徐倩南 ，沈瓊 ，張佳怡 ，張軼倫 ，李莉 ，劉希玲 ，李成濤

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院超聲診斷科，上海 201999；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；5.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060）

在法醫(yī)物證學(xué)檢驗過程中，DNA的量及質(zhì)至關(guān)重要，日常檢案中，常常遇到無法抽提得到足量DNA的情況，尤其當需要進行測序或其他下游反應(yīng)進一步確定個體關(guān)系時（如依靠測序進行同卵雙生子甄別和復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定等），因此，從有限的檢材中獲得足量DNA更為必要。而對于微量檢材來說，雖然可以借助改善DNA提取方法、巢式PCR和增加PCR循環(huán)數(shù)等方法增加從微量DNA獲取的信息，但有研究結(jié)果[1]顯示，使用上述方法對低模板量DNA進行常規(guī)STR分型時，stutter峰數(shù)量增加、等位基因增加或缺失等現(xiàn)象會隨機出現(xiàn)，并且峰的均衡性也將受到嚴重影響?；诔Ｒ?guī)DNA提取進行PCR及STR分型檢測的流程很難得到低模板量DNA的正確STR分型結(jié)果，探索可用于低模板量DNA有效擴增以獲得可靠分型的方法顯得十分必要。

近幾年最新開發(fā)的全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）技術(shù)是一種以微量DNA或幾個甚至單個細胞的全基因組為模板進行非選擇性擴增，通過對模板DNA數(shù)萬甚至數(shù)十萬倍的擴大增加DNA總量的技術(shù)[2-3]。WGA提供了一種從微量基因組DNA中獲取大量遺傳信息的途徑，可能成為法醫(yī)處理微量檢材的一個有用工具。目前基于不同擴增原理已開發(fā)出多種商業(yè)化試劑盒，如PicoPLEXTMWGA Kit（美國Rubicon Genomics公司）、REPLI-g? Single Cell Kit（德國Qiagen公司）和MALBAC?單細胞全基因組擴增試劑盒（江蘇億康基因科技有限公司）等，PicoPLEXTMWGA Kit依據(jù)簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(yīng)（degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR）原理制成，REPLI-g? Single Cell Kit和MALBAC?單細胞全基因組擴增試劑盒分別依據(jù)多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增（multiple annealing and looping based amplification cycle，MALBAC）原理制成[4-6]。2004年時就有學(xué)者對WGA技術(shù)在法醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用進行了研究，WANG等[7]介紹了限制和循環(huán)輔助滾動擴增（restriction and circularization-aided rolling circle amplification，RCARCA）的WGA方法在降解檢材中的應(yīng)用，采用實時熒光定量PCR和基于微陣列的比較基因組雜交（arraybased comparative genomic hybridization，aCGH）技術(shù)評估其擴增效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RCA-RCA對低度及中度降解檢材有較好的擴增效率，但對于高度降解檢材的擴增效率較差。2012年，LEE等[8]評估了應(yīng)用WGA技術(shù)對微量模板DNA擴增后產(chǎn)量和STR分型的情況，實驗采用MDA和改良引物延伸預(yù)擴增（modifiedimproved primer extension preamplification，mIPEP）兩種WGA方法，由于GenomiPhiTMV2 DNA Amplification Kit（瑞典斯德哥爾摩通用電氣醫(yī)療公司）采用了MDA的方法作為試劑盒的設(shè)計原理，因此LEE等在實驗中以GenomiPhiTMV2 DNA Amplification Kit來代表MDA，結(jié)果表明，mIPEP可能更適用于低模板量DNA的擴增，并對mIPEP產(chǎn)物進行了STR分型檢測，指出對于模板量低于100pg的模板，mIPEP可以增加等位基因檢出率。但需要注意的是，使用WGA也會隨機出現(xiàn)等位基因分型偏差及丟失等情況[9-10]。

有研究[11]指出，REPLI-g? Single Cell Kit使用的MDA方法可將微量DNA擴增萬倍。本研究選取REPLI-g?Single Cell Kit分析WGA對微量DNA的擴增效率，通過比較3種不同的微量DNA抽提試劑盒與WGA技術(shù)對DNA提取效率的影響，確認用WGA對微量檢材進行DNA有效擴增的必要性，并選取DNA提取效率較好的試劑盒所提的DNA進行WGA，根據(jù)不同DNA起始量條件下WGA的擴增效率及STR分型效率，探討REPLI-g?Single Cell Kit對微量檢材STR分型的有效性。

1 材料與方法

1.1 樣本

10名健康無關(guān)個體，年齡為24～45歲，每人抽取外周靜脈血2 mL置于5 mL乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝采血管中，使用前儲存于-80℃冰箱中，使用時取出于室溫下靜置直至完全融化后顛倒混勻，用1000μL量程移液器分裝500 μL外周靜脈血于2 mL離心管后，用20 μL量程移液器取10μL抽提DNA，樣本采集均遵循知情同意原則。

1.2 DNA提取

1.2.1 采用PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit

從10名健康無關(guān)個體外周靜脈血中各取10 μL按照PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit（美國Thermo Fisher Scientific公司）操作說明書在AutoMateExpressTMForensic DNA Extraction System（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行DNA提取，得到洗脫體積為50μL的DNA提取物。

1.2.2 采用QIAamp?DNA Investigator Kit

從10名健康無關(guān)個體外周靜脈血中各取10 μL按照QIAamp? DNA Investigator Kit（德國Qiagen 公司）操作說明書在QIAcube DNA自動提取儀（德國Qiagen公司）上進行DNA提取，得到洗脫體積為60μL的DNA提取物。

1.2.3 采用QIAsymphony? DNA Investigator? Kit

從10名健康無關(guān)個體外周靜脈血中各取10 μL按 照 QIAsymphony? DNA Investigator? Kit（德 國Qiagen公司）操作說明書在QIAsymphony SP自動化工作站（德國Qiagen公司）上進行DNA提取，得到洗脫體積為80μL的DNA提取物。

1.2.4 DNA濃度及純度測定

在QubitTM2.0熒光定量儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上使用QubitTMdsDNA HS（High Sensitivity） Assay Kit（美 國 Thermo Fisher Scientific 公司）測定上述3種試劑盒提取所得DNA的濃度，在NanoDrop2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）上測定所提DNA的純度（即D260/D280，值為1.8時DNA純度最好）。

1.2.5 DNA提取數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過配對t檢驗對3種DNA提取試劑盒抽提所得的DNA產(chǎn)量及純度進行統(tǒng)計學(xué)分析。檢驗水準α=0.05。

1.3 WGA

1.3.1 采用REPLI-g?Single Cell Kit進行WGA

按1.2節(jié)操作后，經(jīng)比較，在所得DNA提取效果最好的試劑盒所提取的DNA中，取1份進行濃縮，測定DNA濃度后，使用TE緩沖液分別稀釋至5、1、0.5、0.25、0.125、0.075、0.05 ng/μL 以及 25、12.5、6.25 pg/μL，稀釋后樣本取1μL即可得到相應(yīng)起始樣本量的DNA作為WGA的起始樣本，按照REPLI-g?Single Cell Kit操作說明書進行WGA，每一起始樣本量均重復(fù)3次。

1.3.2 WGA后產(chǎn)物純化

REPLI-g?Single Cell Kit擴增后的產(chǎn)物按照Purification of DNA amplified using REPLI-g?Kits（德國Qiagen公司）操作說明書進行純化。。

1.3.3 DNA質(zhì)量的評估

DNA質(zhì)量主要從DNA產(chǎn)量和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果兩個方面進行檢測，其中計算DNA產(chǎn)量時DNA濃度的測定方法與1.2.4節(jié)中DNA濃度的測定方法相同。

1.3.4 STR分型

使用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A［基點認知技術(shù)（北京）有限公司］對1.3.1節(jié)中各起始樣本量未經(jīng)WGA的DNA及經(jīng)WGA所得DNA進行復(fù)合擴增，在3130xl基因分析儀（美國AB公司）上進行毛細管電泳，檢測結(jié)果采用GeneMapperTMID-Xv3.2.1軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行分析。其中各起始樣本量未經(jīng)WGA的STR分型結(jié)果既是實驗所用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A的靈敏度檢驗結(jié)果，也是實驗中經(jīng)WGA所得DNA對照樣本的STR分型結(jié)果。對各起始樣本量未經(jīng)WGA的DNA重復(fù)3次復(fù)合擴增后分別進行毛細管電泳，經(jīng)WGA所得DNA樣本則對在WGA過程中已設(shè)置的3次重復(fù)分別復(fù)合擴增后進行毛細管電泳，由此獲得3次重復(fù)的STR分型結(jié)果。

1.3.5 STR分型結(jié)果的數(shù)據(jù)處理

對STR分型結(jié)果進行分析時參考文獻[8]使用的分型分析原則：（1）峰值大于50相對熒光信號單位（relative fluorescence unit，RFU）的等位基因視為真實等位基因。（2）計算等位基因符合數(shù)和符合率，基因座符合數(shù)和符合率。等位基因符合數(shù)指經(jīng)WGA后樣本STR分型與足量模板完整正確STR分型所得等位基因相一致的等位基因個數(shù)，等位基因符合率由該梯度下實際檢出等位基因符合數(shù)除以此試劑盒針對足量模板完整正確檢出等位基因數(shù)得出（此樣本完整檢出等位基因數(shù)為34個）?；蜃蠑?shù)指經(jīng)WGA后樣本STR分型與足量模板完整正確STR分型基因座相一致的基因座個數(shù)，基因座符合率由該梯度下實際檢出基因座符合數(shù)除以此試劑盒針對足量模板完整正確檢出基因座數(shù)得出（此樣本完整檢出基因座數(shù)為20個）。（3）在所有雜合子基因座中計算均衡基因座所占百分比，峰值比低于70%視為不均衡（總雜合子基因座數(shù)為14個）。（4）將總體濾過系數(shù)設(shè)為10%來定義額外等位基因，即每個正確分型基因座中低于此基因座最大峰值10%的等位基因視為額外等位基因，此處的額外等位基因?qū)儆诨蜃緫?yīng)包含的等位基因。（5）將檢出的基因座中本應(yīng)存在的等位基因之外的等位基因視為多余等位基因，對于雜合子基因座而言無論最小峰值是否低于最大峰值的10%，只要是該試劑盒針對此樣本基因座所含等位基因之外的等位基因均視為多余等位基因，例如，本應(yīng)為純合子的基因座出現(xiàn)兩個或多個等位基因，則將多出的等位基因視為多余等位基因。（6）計算基因座重合數(shù)。為了進一步確認經(jīng)WGA后STR分型的重現(xiàn)性以及客觀反映WGA的忠實性（擴增結(jié)果的一致性），本研究對3次重復(fù)之間的基因座重合數(shù)（即分型一致的基因座個數(shù)）進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取

3種試劑盒提取DNA純度（D260/D280）、質(zhì)量濃度、溶液體積、產(chǎn)量以及產(chǎn)量最大值和最小值的比較見表1。由表1可看出，本研究選取3種DNA提取試劑盒對10名健康無關(guān)個體外周靜脈血抽提DNA后所得DNA產(chǎn)量在55.90～209.07ng。使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，3種DNA提取試劑盒抽提所得DNA的產(chǎn)量及純度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。比較DNA純度時發(fā)現(xiàn)，PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit所提DNA純度最好，其次為QIAsymphony? DNA Investigator? Kit，最后是QIAamp? DNA Investigator Kit。比較DNA產(chǎn)量時發(fā)現(xiàn)，QIAsymphony? DNA Investigator? Kit所提DNA產(chǎn)量最高，其次為 QIAamp? DNA Investigator Kit，最后是 PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit。并最終選取了DNA產(chǎn)量最高、純度較好的QIAsymphony?DNA Investigator?Kit所提DNA作為WGA的起始樣本。

2.2 WGA效率

2.2.1 擴增產(chǎn)量及擴增倍數(shù)

經(jīng)WGA后DNA的產(chǎn)量及不同起始樣本量下的擴增倍數(shù)見表2。從表中可以看出，REPLI-g?Single Cell Kit可對微量DNA進行高效率的擴增。在所設(shè)梯度中，REPLI-g?Single Cell Kit擴增所得產(chǎn)物產(chǎn)量高、擴增倍數(shù)大，且隨著模板DNA量的減少，擴增產(chǎn)物產(chǎn)量保持在相對穩(wěn)定的水平，使得REPLI-g?Single Cell Kit擴增倍數(shù)成指數(shù)式增大。WGA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物DNA片段大且集中（圖1）。

表1 3種試劑盒提取DNA純度、質(zhì)量濃度、溶液體積、產(chǎn)量以及產(chǎn)量最大值和最小值的比較（n=10，±s）

表1 3種試劑盒提取DNA純度、質(zhì)量濃度、溶液體積、產(chǎn)量以及產(chǎn)量最大值和最小值的比較（n=10，±s）

注：1）與PrepFiler Express BTATMForensic DNA Extraction Kit比較，P＜0.05；2）與QIAamp? DNA Investigator Kit比較，P＜0.05

試劑盒PrepFiler Express BTATMForensic DNA Extraction Kit QIAamp?DNA Investigator Kit QIAsymphony? DNA Investigator? Kit純度1.89±0.07 2.11±0.181）1.52±0.211）2）質(zhì)量濃度/（ng·μL-1）1.57±0.29 1.96±0.37 1.79±0.42溶液體積/μL 50 60 80±s 78.66±14.41 117.65±22.061）143.02±33.741）2）產(chǎn)量/ng x 最大值103.83 147.78 209.07最小值55.90 70.24 86.45

表2 WGA后DNA的產(chǎn)量及擴增倍數(shù) （n=3）

圖1 不同起始樣本量經(jīng)REPLI-g?Single Cell Kit進行WGA后產(chǎn)物DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2.2 STR分型

對本研究采用的Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A進行靈敏度檢驗時發(fā)現(xiàn)，起始樣本量在0.5ng及以上時可出現(xiàn)完整分型，在0.5 ng以下時，隨著上樣量的減少，等位基因檢出數(shù)降低（表3）。各起始樣本量下未經(jīng)WGA樣本及WGA樣本的STR分型結(jié)果見表3。從結(jié)果可以看出，在6.25pg～0.25ng經(jīng)WGA后的樣本較未經(jīng)WGA樣本STR分型成功率高，無論從等位基因符合數(shù)、符合率或基因座符合數(shù)、符合率來看，WGA均具有顯著的優(yōu)勢，這種現(xiàn)象可在多個梯度中出現(xiàn)。值得注意的是，在0.5～5ng，未經(jīng)WGA樣本的分型效果更好。此外，對基因座均衡百分比分析時發(fā)現(xiàn)，起始樣本量在0.05～5ng梯度，除0.25ng時出現(xiàn)經(jīng)WGA樣本基因座均衡性優(yōu)于未經(jīng)WGA樣本外，其余梯度下未經(jīng)WGA樣本的基因座均衡性均優(yōu)于經(jīng)WGA后的樣本。在6.25～25pg，經(jīng)WGA樣本基因座均衡性優(yōu)于未經(jīng)WGA樣本。同時，未經(jīng)WGA樣本分型結(jié)果中不存在額外等位基因，但經(jīng)REPLI-g?Single Cell Kit進行WGA后，在起始樣本量為0.05ng、25pg、6.25 pg時，出現(xiàn)平均值分別為0.33（SD=0.58）的額外等位基因。對多余等位基因分析時發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)WGA樣本在起始樣本量為0.075 ng、0.05 ng、25 pg和12.5 pg時分別出現(xiàn)平均值為1.00（SD=1.00）、0.33（SD=0.58）、0.33（SD=0.58）和0.33（SD=0.58）的多余等位基因，經(jīng)WGA樣本在起始樣本量為0.5ng、12.5pg和6.25pg時分別出現(xiàn)了平均值為1.00（SD=0.00）、1.00（SD=1.00）和0.67（SD=0.58）的多余等位基因。對經(jīng)WGA樣本基因座重合數(shù)分析時發(fā)現(xiàn)，隨著起始模板量的降低，基因座重合數(shù)呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢。

表3 不同起始樣本量未經(jīng)WGA和經(jīng)WGA后的STR分型結(jié)果 （n=3，±s）

表3 不同起始樣本量未經(jīng)WGA和經(jīng)WGA后的STR分型結(jié)果 （n=3，±s）

起始樣本量5ng 1ng 0.5ng 0.25ng 0.125ng 0.075ng 0.05ng 25pg 12.5pg 6.25pg方法未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA未經(jīng)WGA WGA等位基因檢出數(shù)/個34.00±0.00 32.67±2.31 34.00±0.00 29.67±6.66 34.00±0.00 34.67±0.58 17.67±10.50 28.67±0.58 18.67±14.19 28.00±4.00 18.33±1.16 19.33±3.79 19.33±8.39 22.00±3.46 7.33±0.58 18.67±2.08 7.67±0.58 13.33±1.16 6.00±0.00 7.33±1.16等位基因符合數(shù)/個34.00±0.00 32.67±2.31 34.00±0.00 29.67±6.66 34.00±0.00 33.67±0.58 17.67±10.50 28.67±0.58 18.67±14.19 28.00±4.00 17.33±1.53 19.33±3.79 19.00±8.66 22.00±3.46 7.00±0.00 18.00±2.65 7.33±0.58 9.67±1.53 5.00±0.00 5.67±0.58等位基因符合率/%100.00±0.00 96.08±6.79 100.00±0.00 87.25±19.58 100.00±0.00 99.02±1.70 51.96±30.89 84.31±1.70 54.90±41.73 82.35±11.76 50.98±4.49 56.86±11.14 55.88±25.47 64.71±10.19 20.59±0.00 52.94±7.78 21.57±1.70 28.43±4.49 14.71±0.00 16.67±1.70基因座符合數(shù)/個20.00±0.00 18.67±2.31 20.00±0.00 17.33±3.79 20.00±0.00 18.67±0.58 9.00±5.57 15.00±1.00 11.33±8.51 14.67±3.06 9.67±2.08 10.33±1.16 11.00±5.29 10.33±2.89 3.67±0.58 9.67±2.08 4.00±1.00 4.33±1.16 3.00±0.00 2.33±1.53基因座符合率/%100.00±0.00 93.33±11.55 100.00±0.00 86.67±18.93 100.00±0.00 93.33±2.89 45.00±27.84 75.00±5.00 56.67±42.52 73.33±15.28 48.33±10.41 51.67±5.77 55.00±26.46 51.67±14.43 18.33±2.89 48.33±10.41 20.00±5.00 21.67±5.77 15.00±0.00 11.67±7.64基因座均衡百分比/%100.00±0.00 69.05±8.25 85.71±18.90 42.86±14.29 88.10±10.91 42.86±7.14 19.05±20.62 28.57±21.43 42.86±44.61 21.43±7.14 16.67±4.12 14.29±18.90 16.67±16.50 11.90±4.12 4.76±4.12 11.90±4.12 2.38±4.12 4.76±4.12 0.00±0.00 2.38±4.12額外等位基因數(shù)/個0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.33±0.58 0.00±0.00 0.33±0.58 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.33±0.58多余等位基因數(shù)/個0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.00±1.00 0.00±0.00 0.33±0.58 0.00±0.00 0.33±0.58 0.00±0.00 0.33±0.58 1.00±1.00 0.00±0.00 0.67±0.58基因座重合數(shù)/個20.00±0.00 17.33±3.33 20.00±0.00 14.67±3.79 20.00±0.00 18.33±0.58 13.33±4.93 13.33±3.21 10.33±4.04 12.67±1.53 8.00±1.00 8.67±1.15 7.67±1.15 9.00±1.00 3.67±1.15 6.67±1.53 4.33±0.58 3.67±1.53 4.00±0.00 1.33±0.58

3 討 論

3.1 DNA提取

根據(jù)實驗結(jié)果來看，本實驗選取的3種試劑盒均可對微量檢材DNA進行提取，其中PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit所提DNA純度最好，與BALSA等[12]的報道一致。QIAsymphony?DNA Investigator? Kit所提DNA產(chǎn)量最高，與IP等[13]的報道一致。此種結(jié)果的產(chǎn)生可能與各試劑盒提取DNA的原理不同相關(guān)，PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit和QIAsymphony? DNA Investigator? Kit采用磁珠法提取DNA，QIAamp?DNA Investigator Kit采用柱膜法提取DNA。

然而經(jīng)進一步的比較發(fā)現(xiàn)，QIAsymphony?DNA Investigator? Kit和 PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit雖然采用同樣的原理提取DNA，但所得DNA產(chǎn)量差異較大。具體表現(xiàn)為采用磁珠法原理進行DNA提取的QIAsymphony?DNA Investigator? Kit比采用柱膜法的QIAamp? DNA Investigator Kit所提DNA產(chǎn)量高，而采用柱膜法的QIAamp?DNA Investigator Kit卻比同樣采用磁珠法原理進行DNA提取的PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit所提DNA產(chǎn)量高。分析發(fā)現(xiàn)，3種試劑盒除原理不同外，洗脫體積也存在差異，因此上述現(xiàn)象的發(fā)生也可能與PrepFilerExpressBTATMForensic DNA Extraction Kit在提取過程中的洗脫體積小相關(guān)，洗脫體積過小將導(dǎo)致部分吸附在磁珠上的DNA無法與磁珠分離，從而影響DNA產(chǎn)量。

3.2 WGA

本研究主要從擴增效率和STR分型情況兩個方面對WGA應(yīng)用于微量DNA擴增時的效率進行了評估。其中擴增效率指將模板放大的倍數(shù)[14]。實驗中，REPLI-g?Single Cell Kit最高可將微量DNA擴增106倍左右，獲得了產(chǎn)量高的DNA。這可能與REPLI-g?Single Cell Kit采用的WGA原理相關(guān)。REPLI-g?Single Cell Kit采用MDA的方法對模板進行WGA，同時擴增兩條DNA鏈，呈現(xiàn)指數(shù)擴增的趨勢，因此使得DNA產(chǎn)量高、擴增倍數(shù)大。在起始樣本量為6.25pg時，DNA產(chǎn)量平均值為8.77×103ng，瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示DNA片段大且集中，依據(jù)實驗采用的Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒說明書來看，滿足STR分型時對DNA起始量的要求。

從結(jié)果中也可看出，WGA隨著起始樣本量的降低，STR分型成功率逐漸降低，與起始樣本量較高的未經(jīng)WGA樣本的STR分型結(jié)果相比仍然存在不足，且在起始樣本量過低時無法得到足夠多的正確基因座分型結(jié)果以滿足個體識別或者親權(quán)鑒定的需要，此現(xiàn)象可能與隨機效應(yīng)相關(guān)。當模板量極少時，PCR擴增會發(fā)生隨機效應(yīng)，隨機優(yōu)先擴增某段序列，形成明顯的不對稱擴增，甚至造成等位基因的丟失[15]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)WGA擴增后STR分型中額外等位基因和多余等位基因的出現(xiàn)是隨機的，不具有基因座特異性和等位基因特異性，前期關(guān)于等位基因丟失和不平衡的分析[16]也提到了相似的現(xiàn)象。隨著起始樣本量減少，基因座檢出數(shù)減少的同時基因座重合數(shù)也逐漸減少，說明WGA的忠實性有待進一步考證。有報道[9]指出，只有當模板質(zhì)量高時，WGA才能較好地發(fā)揮其優(yōu)勢，本研究結(jié)果與之相符。

3.3 結(jié)論

REPLI-g?Single Cell Kit基于MDA的原理對微量DNA進行WGA，此項技術(shù)是一種不依賴PCR的WGA策略，可對整個基因組均衡擴增，所應(yīng)用的Phi29 DNA聚合酶有很強的鏈置換能力，呈級聯(lián)效應(yīng)放大模板DNA[17]。通過本研究得出REPLI-g?Single Cell Kit在擴增產(chǎn)量、擴增倍數(shù)方面表現(xiàn)良好，當模板量較低時雖然擴增產(chǎn)量及擴增倍數(shù)較高，但其STR分型效率顯著降低，使得其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用受到了限制，然而相對于同等梯度下未經(jīng)WGA樣本來說，WGA方法依然表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢?？偠灾琑EPLI-g?Single Cell Kit所代表的WGA技術(shù)是一種能有效增加微量DNA的方法，在法醫(yī)學(xué)中具有重要的應(yīng)用價值。