王致遠，王迪佳，李燃，李海霞，汪娜娜，孫宏鈺

（1.中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510089；2.佛山市公安局，廣東 佛山 528000；3.深圳市公安局龍華分局，廣東 深圳 518109）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）具有突變率低（僅為STR的十萬分之一）、擴增片段短、數(shù)量豐富等特點，被稱為第三代遺傳標記[1-3]。但是，由于單個SNP位點通常只有兩個等位基因，多態(tài)性較STR相對低，因此要檢測更多的SNP位點才能達到法醫(yī)學個體識別和親子鑒定的檢測需求。SANCHEZ等[4-5]基于傳統(tǒng)的毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術開發(fā)了包含52個SNP位點的SNPforID檢測體系，研究結果顯示，其可以應用于個體識別，但是仍然難以滿足親緣關系分析的要求。

近年來，大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS）技 術 ，又 稱 為 高 通 量 測 序（highthroughput sequencing，HTS）技術或下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術，發(fā)展迅速，能夠同步檢測的遺傳數(shù)目增多，檢測成本降低[6-7]。本課題組前期基于Ion TorrentTM平臺的HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel分型體系，探索了90個常染色體SNP位點在廣東漢族群體的多態(tài)性[8]，本研究擬基于狀態(tài)一致性（identity by state，IBS）分析策略，探索這90個SNP位點在全同胞關系分析中的效能。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和DNA提取

在知情同意原則下，采集中國漢族一個四代家系共35個成員的血樣，個體之間關系如圖1所示。使用AutoMateExpressTMForensic DNA Extraction System（美國Thermo Fisher Scientific公司）提取DNA，并使用 QubitTMdsDNA HS Assay Kit（美國 Thermo Fisher Scientific公司）在QubitTM3.0熒光定量儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進行DNA定量。另外，根據(jù)本課題組前期研究中的無關個體SNP分型數(shù)據(jù)[8]隨機組合獲得1000對無關個體（unrelated individual，UI）。

圖1 本研究對象的四代家系系譜圖

1.2 常染色體STR分型

采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)25A［基點認知技術（北京）公司］對23個常染色體STR基因座進行擴增，在3500xL基因分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進行檢測，并使用GeneMapper?ID-Xv1.5軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行STR分型。

1.3 常染色體SNP分型

采用Precision ID Identity Panel（美國Thermo Fisher Scientific公司）和Ion AmpliSeqTMLibrary Kit（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行文庫構建[8]。該檢測體系可同時檢測90個常染色體身份信息SNP（identity informative SNP，iiSNP）以及34個Y-SNP位點。擴增產物使用Ion ChefTMSystem（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行自動化模板制備，應用Ion 520TM或 Ion 530TMKit（美 國 Thermo Fisher Scientific公司）在Ion S5TMXL System（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進行測序。測序結果采用Torrent SuiteTMv5.2.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行分析，同時結合HID SNP Genotyper Plugin v4.3.1軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行SNP分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對于家系中的所有父-母-子關系，根據(jù)23個常染色體STR的分型結果，計算親權指數(shù)（paternity index，PI），依照行業(yè)技術規(guī)范[9]，如果累積親權指數(shù)（combined paternity index，CPI）大于10000，則支持他們之間的親子關系?；谠摷蚁倒搏@得全同胞（full sibling，F(xiàn)S）、祖孫（grandparent-grandchild，GG）、叔侄（姨甥）（uncle/aunt-nephew/niece，UN）和第一代堂表親（first cousin，F(xiàn)C）共4種親緣關系類型。參考《生物學全同胞鑒定實施規(guī)范》[10]，分別計算各種關系類型的IBS評分，采用R語言繪制各關系類型的IBS分布圖[11]。采用Wilcoxon秩和檢驗比較全同胞與其他親緣關系類型IBS評分分布的差異，檢驗水準α=0.05。采用SPSS 20.0軟件建立各種關系的Fisher判別函數(shù)[12]。以待鑒定個體對的IBS評分作為判別因子（S），分別代入相應的判別函數(shù)獲得判別評分L值，并將該對個體的關系類型歸為L值較大的組別。同時，基于前期研究獲得的頻率數(shù)據(jù)[8]，分別模擬10 000對4種親緣關系和無關個體樣本對。參考《生物學全同胞關系鑒定實施規(guī)范》[10]，對于待鑒定個體對，如果其IBS評分小于或等于某一閾值（下限值t1），則判定為無關個體；如果大于或等于另一閾值（上限值t2），則判定為對應親緣關系；如果在t1和t2之間，則無法判定?；诖嗽O定探索錯判率分別為≤0.01%、≤0.05%、≤0.1%、≤0.5%和≤1%時的判定閾值以及相應的系統(tǒng)效能。

2 結 果

2.1 SNP測序概況

對于該家系的35個樣本共進行了3批測序，裝載（chip loading）比例分別為62%、70%、73%，富集率（enrichment）分別為93%、95%、95%，單克?。╩onoclonal）比例分別為64%、67%、67%，總計獲得超過1 400萬條序列（reads）。35個樣本在90個SNP位點均獲得完整分型，分型率為100%。

2.2 家系成員關系確認

根據(jù)23個常染色體STR分型結果對本研究四代家系中所有的父-母-子關系進行了確認，基于該家系樣本可獲得的親緣關系類型及數(shù)量如表1所示。

表1 本研究四代家系樣本的關系類型及數(shù)量

2.3 各類親緣關系的IBS評分分布

基于該90個SNP分型結果，在256對親緣關系中，全同胞的平均IBS評分最高（IBS=148），第一代堂表親的平均IBS評分最低（IBS=124）。祖孫、叔侄（姨甥）的平均IBS分值分別為130、132。相比之下，無關個體的IBS評分最低，平均僅為120。各種關系類型的IBS分布情況如圖2所示。

經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗，除了祖孫與叔侄（姨甥）的IBS評分差異無統(tǒng)計學意義（P=0.719）外，其余關系類型之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 5種關系類型基于90個SNP分型的IBS分布

2.4 Fisher判別函數(shù)法進行親緣關系判定

通過Fisher判別函數(shù)進行4種親緣關系的判定，結果見表2。其中，全同胞關系全部被正確評判為相應的親緣關系，對于更遠的親緣關系，錯判率顯著升高。綜合考慮無關個體的判定結果，判別函數(shù)法對全同胞關系判定的準確率最高（98.7%），對第一代堂表親判定的準確率最低（61.3%）。

表2 基于90個SNP分型建立的4種關系判別函數(shù)及分析結果

2.5 IBS閾值法進行親緣關系判定

基于前期研究，本研究模擬了10000對4種親緣關系和無關個體樣本，全同胞的IBS分布情況見圖3。

參考《生物學全同胞關系鑒定實施規(guī)范》[10]，本研究計算了在不同錯判率下各類親緣關系IBS評分的判定閾值及相應的系統(tǒng)效能，結果見表3。

從表3可以看出，在相同錯判率下，全同胞關系鑒定的系統(tǒng)效能最高，第一代堂表親關系鑒定效能最低。

圖3 基于90個SNP分型的全同胞IBS分布

表3 基于90個SNP分型建立的各種親緣關系IBS判定閾值及系統(tǒng)效能

另外，可根據(jù)此表靈活選擇判定閾值。以全同胞關系為例，當設定錯判率≤0.05%時，如果某對樣本IBS評分≤128，則判定為無關個體，如果≥141，則判定為全同胞，相應的系統(tǒng)效能為0.8814，即88.14%的案例可以獲得明確的鑒定意見。

3 討 論

目前，國內司法系統(tǒng)使用的《生物學全同胞關系鑒定實施規(guī)范》基于STR分型結果，采用IBS評分法提出判斷全同胞、無法判斷、無關個體的標準和檢測效能[10]。相對于似然比（likelihood ratio）法，IBS評分法無需考慮等位基因頻率，只需要根據(jù)等位基因共享情況即可進行親緣關系判定，具有分析直觀、簡單、快速的優(yōu)勢[11，13-15]。另一方面，對于特殊案例，如高度腐敗或者降解檢材，常常無法獲得完整STR分型，而SNP由于擴增片段短可以獲得完整分型。并且隨著NGSSNP分型體系的日益成熟，將越來越廣泛地應用于法醫(yī)學個體識別和親緣鑒定[16]，因此本研究采用Precision ID Identity Panel分型體系對90個SNP位點進行分型，結合IBS策略探索了該檢測體系在全同胞關系鑒定中的應用價值。

本研究結果顯示，全同胞、祖孫、叔侄（姨甥）和第一代堂表親4種親緣關系中，除了祖孫與叔侄（姨甥）關系外，其余關系類型的IBS評分差異均有統(tǒng)計學意義，且均高于無關個體。祖孫與叔侄（姨甥）的IBS評分無顯著差異，可解釋為這兩類親緣關系同屬于二級親緣關系，理論上他們之間均共有四分之一的親代遺傳物質。另外，隨著親緣關系的疏遠，IBS分值逐漸降低。親緣關系中的第一代堂表親與無關個體的IBS差異最小。

本研究根據(jù)90個SNP分型數(shù)據(jù)建立了4種親緣關系的Fisher判別函數(shù)，綜合無關個體的判定結果后對全同胞關系的錯判率為1.3%，低于趙書民等[12]研究中的2.98%。分析原因為本研究包含的90個SNP位點相當于22個STR基因座的多態(tài)性[17]，多于趙書民等研究中采用的Identifiler系統(tǒng)STR數(shù)目（15個STR）。但是，對于其他較遠親緣關系的錯判率較高，尚不能滿足實踐需求。

此外，由于判別函數(shù)法具有“是”或者“否”的二分類特征，不存在無法判定的“灰色區(qū)域”，系統(tǒng)效能高，但是錯判率相對也較高。本研究采用判別函數(shù)法進行全同胞關系的錯判率為1.3%，顯著高于根據(jù)《生物學全同胞關系鑒定實施規(guī)范》及趙書民等[12-13]研究采用19個STR和IBS閾值法（t1=13，t2=22）的錯判率（≤0.05%）。本研究基于前期獲得的頻率數(shù)據(jù)，模擬了10000對各種親緣關系和無關個體，獲得了相應的IBS判定閾值。結果表明，當錯判率低至0.05%時，進行全同胞鑒定的系統(tǒng)效能為0.881 4，高于采用19個STR時的效能（0.75）[10]，提示這90個SNP可以應用于全同胞關系鑒定。因此，當采用這90個SNP進行鑒定時，推薦使用對應的閾值t1=128、t2=141作為全同胞的判定標準。如果允許的錯判率提高，相應的系統(tǒng)效能更大。實際工作中可以根據(jù)需要，選擇不同的標準和閾值進行判定，這也顯示了IBS閾值法的靈活性。

值得一提的是，檢測體系包含的SNP位點數(shù)目越多，對于各類親緣關系鑒定的鑒別能力以及準確率越高。KLING等[18-19]應用高密度SNP芯片技術檢測了超過90萬個SNP位點，以共有等位基因數(shù)目作為判定參數(shù)，發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分至第二代堂兄弟（姐妹）的關系。這也顯示了SNP遺傳標記和IBS策略在親緣關系鑒定中的應用潛力，本研究下一步擬基于更大數(shù)量的實驗樣本和實際案例進行驗證。