黃俊杰 ，姚藝 ，夏崇建 ，趙雅頔 ，余思 ，高原 ，葉光華 ，喻林升 ，范琰琰

（1.溫州醫(yī)科大學法醫(yī)學系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學司法鑒定中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學司法鑒定科學技術研究所，浙江 溫州 325035）

糖尿病是嚴重威脅人類健康的代謝性疾病，以2型糖尿病為多見，占糖尿病患者的90%以上[1]。據統(tǒng)計，當今中國人群的糖尿病發(fā)病率為11.6%，預計到2030年，全世界的糖尿病患者將達到4.39億[2-3]。如果糖尿病發(fā)病初期未進行有效的血糖控制，持續(xù)的高血糖會產生一系列嚴重的并發(fā)癥，如糖尿病腎病、心血管并發(fā)癥、眼部并發(fā)癥及損傷愈合能力受損等。研究結果[4-6]表明，持續(xù)的高血糖會使機體產生代謝記憶。因此，發(fā)病初期未控制血糖的嚴重糖尿病患者難以再通過控制血糖避免糖尿病并發(fā)癥的出現。研究結果[6]證實，糖尿病斑馬魚在血糖控制到正常范圍后其損傷愈合能力受損并未得到改善。

損傷形成時間推斷是法醫(yī)學研究的重要課題。在法醫(yī)學鑒定中，偶爾會遇到嚴重糖尿病患者遭受損傷形成創(chuàng)口。由于糖尿病導致損傷愈合能力受損，因此其創(chuàng)口愈合規(guī)律不同于正常人。雖然許多指標被證實可用于損傷時間的推斷，但糖尿病損傷形成時間的推斷未能引起足夠的重視。本課題組之前的研究結果[7-8]顯示，與正常損傷相比，糖尿病損傷愈合延遲，創(chuàng)口內炎癥細胞浸潤出現慢且不易消退，而參與損傷修復的成纖維細胞數量減少。基于上述研究現狀，本研究選取具有明顯高血糖的2型糖尿病DB小鼠及其相同周齡的正常對照小鼠，建立損傷愈合模型，應用免疫組織化學染色技術觀察損傷愈合期間的中性粒細胞及肌成纖維細胞的數量，旨在為糖尿病損傷形成時間的推斷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物損傷愈合模型的制備及分組

8～10周齡雄性糖尿病DB小鼠（C57BL/KsJ-db/db）及其相同周齡血糖正常的雄性對照小鼠（C57BL/KsJ）購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，其中糖尿病DB小鼠從4周齡開始出現持續(xù)的高血糖，未控制血糖水平。對照組及糖尿病組小鼠均被隨機分為8個損傷亞組和1個未致傷亞組，每組5只。損傷亞組小鼠使用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（70mg/kg）麻醉后，在背部剃毛、乙醇消毒，使用手術刀片在小鼠背部皮膚正中切割一條長1.5 cm的全層縱向切口。待小鼠復蘇后分籠飼養(yǎng)，注意保持創(chuàng)口干燥，避免感染。損傷亞組在傷后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d過量麻醉處死小鼠，取創(chuàng)口及其周圍2.0cm×1.5cm大小的皮膚標本進行免疫組織化學染色。未致傷亞組小鼠不進行創(chuàng)口切割，過量麻醉處死后，取相同部位同等大小的皮膚標本進行檢測。

本實驗經溫州醫(yī)科大學倫理委員會審核通過，符合《實驗動物 福利倫理審查指南》要求。

1.2 免疫組織化學染色

小鼠皮膚樣本放入由磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制的4%多聚甲醛溶液中進行固定，固定后進行沖水、脫水、透明、浸蠟及包埋，用石蠟切片機制成5 μm厚的連續(xù)切片。切片烘干、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、水化，置于3%過氧化氫溶液中室溫孵育10min滅活內源性過氧化物酶。切片經抗原修復、室溫冷卻后，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉2 h，滴加兔抗小鼠中性粒細胞（neutrophil）多克隆抗體（1∶300，LS-C348175，美國LifeSpan BioSciences公司）或兔抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（1∶1 000，ab124964，英國Abcam公司），保濕盒中4℃孵育12h，PBS洗滌3次，滴加辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔 IgG（PV-6001，北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育20 min。PBS洗滌3次，使用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒進行顯色，蘇木素復染細胞核。另使用PBS代替一抗作為陰性對照，未見假陽性染色。

顯微鏡下在創(chuàng)口及其周邊區(qū)隨機選取10個高倍視野（×400）進行觀察、拍照和分析，統(tǒng)計中性粒細胞（neutrophil陽性細胞）及肌成纖維細胞（α-SMA陽性細胞）在每個視野的平均數量。

1.3 數據處理

數據采用表示，使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析進行組間比較，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

與對照組相比，糖尿病組小鼠的創(chuàng)口收縮及愈合延遲。在對照組及糖尿病組的損傷樣本中，浸潤的多形核細胞顯示了neutrophil抗體的陽性反應，表明其是中性粒細胞；在損傷修復期，部分梭形或紡錘形的成纖維樣細胞表達α-SMA，表明其是肌成纖維細胞。在對照組及糖尿病組的未致傷小鼠皮膚中，部分血管壁顯示α-SMA的陽性染色，未見肌成纖維細胞或浸潤的中性粒細胞。

對照組損傷樣本中，傷后6h可見中性粒細胞浸潤，浸潤的中性粒細胞數量于傷后12h達峰值，于傷后3d開始顯著減少。糖尿病組損傷樣本中，傷后6h僅見少量中性粒細胞浸潤，此后浸潤的中性粒細胞數量緩慢增多，于傷后5d達峰值，傷后7～10d仍可見較多的中性粒細胞浸潤。與對照組相比，糖尿病組創(chuàng)口浸潤的中性粒細胞數量在傷后6 h～1 d減少，在傷后5～14d增多。傷后5～10d，糖尿病組創(chuàng)口每個高倍視野的中性粒細胞平均數量大于30，而對照組創(chuàng)口的中性粒細胞平均數量小于20。結果見圖1、表1。

對照組損傷樣本中，傷后6 h～1 d未見肌成纖維細胞，傷后3d大部分樣本的創(chuàng)底邊緣可見少量肌成纖維細胞分布，傷后5d所有樣本的創(chuàng)底和創(chuàng)腔邊緣均可見肌成纖維細胞，肌成纖維細胞數量于傷后7 d達峰值，于傷后14 d顯著減少。糖尿病組損傷樣本中，傷后6h～3d未見肌成纖維細胞，傷后5d僅2個樣本的創(chuàng)底邊緣見少量肌成纖維細胞，傷后7d所有樣本的創(chuàng)底和創(chuàng)腔邊緣均可見肌成纖維細胞，肌成纖維細胞數量于傷后10d達到峰值。與對照組相比，糖尿病組傷后參與修復的肌成纖維細胞數量減少，兩組肌成纖維細胞數量在傷后3～7d差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果見圖2、表1。

A：對照組傷后12h；B：對照組傷后5d；C：對照組傷后10d；D：糖尿病組傷后12h；E：糖尿病組傷后5d；F：糖尿病組傷后10d

圖2 小鼠創(chuàng)口肌成纖維細胞的免疫組織化學染色結果（×400）

表1 對照組與糖尿病組小鼠傷后各時間點的中性粒細胞及肌成纖維細胞數量（n=5，±s）

表1 對照組與糖尿病組小鼠傷后各時間點的中性粒細胞及肌成纖維細胞數量（n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05；2）與對照組傷后相同時間點比較，P＜0.05

1.1±1.52）22.3±8.11）2）37.2±8.31）15.0±7.61）損傷時間6h 12h 1d 3d 5d 7d 10d 14d中性粒細胞對照組14.5±1.2 42.9±4.31）38.7±5.6 23.5±5.41）15.1±3.61）9.7±2.31）5.2±1.51）3.5±0.9糖尿病組3.7±2.12）11.3±5.81）2）20.5±4.61）2）26.8±5.3 43.2±5.11）2）41.5±4.92）35.1±4.72）15.7±4.21）2）肌成纖維細胞對照組 糖尿病組000 000 4.6±2.81）25.2±5.91）52.7±10.21）46.9±7.5 18.6±7.11）02）

3 討 論

損傷愈合是一個多細胞、多分子參與的復雜過程，可分為炎癥期、增殖期和再塑期3個階段。炎癥反應在創(chuàng)口愈合中起到承前啟后的作用，是一把雙刃劍。早期的炎癥反應對創(chuàng)口愈合是必要的，而持續(xù)的炎癥反應則會抑制創(chuàng)口修復。在炎癥期，中性粒細胞首先浸潤至創(chuàng)口，殺滅創(chuàng)口內細菌并清除壞死組織，同時釋放趨化因子促進單核-巨噬細胞募集。然后，中性粒細胞發(fā)生凋亡，被浸潤的巨噬細胞吞噬、清除，這種吞噬細胞移除凋亡細胞的過程稱為胞葬。胞葬可促進巨噬細胞從促炎表型轉換為促修復表型，使其分泌生長因子，如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），進而促進成纖維細胞增殖并分化為肌成纖維細胞，調節(jié)創(chuàng)口從炎癥期向增殖期過渡[9-13]。

創(chuàng)口內凋亡的中性粒細胞必須被巨噬細胞通過胞葬作用及時清除，否則會繼發(fā)壞死并釋放細胞毒性物質，引起組織二次損傷和持續(xù)的炎癥反應[14-17]。大量研究[9，13，17-22]提示，糖尿病創(chuàng)口呈現巨噬細胞胞葬功能受損及向促修復表型轉換障礙，繼而引起創(chuàng)口內過度的中性粒細胞浸潤和促炎因子水平增高，并減少抗炎因子和生長因子的表達，最終導致持續(xù)的炎癥及創(chuàng)口修復遲滯。本課題組前期研究[7-8]結果顯示，與正常損傷愈合相比，糖尿病損傷修復后期出現巨噬細胞數量和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達的增多，而參與修復的成纖維細胞數量減少，提示糖尿病創(chuàng)口具有紊亂的炎癥反應和受損的纖維性修復。

本研究結果顯示，在作為對照組的正常損傷愈合樣本中，中性粒細胞數量于傷后12h達峰值，于傷后3d開始顯著減少。該研究結果與WANG等[23]的研究結果一致，提示正常損傷愈合的中性粒細胞浸潤及清除發(fā)生較快。此外，與對照組創(chuàng)口相比，糖尿病組創(chuàng)口浸潤的中性粒細胞數量在傷后6 h～1 d顯著減少，于傷后5d開始顯著增多，而傷后5～14d參與修復的肌成纖維細胞數量較少。本研究結果提示，在糖尿病損傷愈合過程中，中性粒細胞浸潤發(fā)生較慢，而且浸潤的中性粒細胞不易被清除，愈合后期過度的中性粒細胞浸潤和減少的肌成纖維細胞數量是糖尿病損傷修復的特征。

從法醫(yī)學應用的角度考慮，結合觀察中性粒細胞及肌成纖維細胞可為糖尿病損傷形成時間的推斷提供參考依據。本研究結果顯示，肌成纖維細胞出現于傷后3～14d的對照組創(chuàng)口及傷后5～14d的糖尿病組創(chuàng)口。傷后5～10d，糖尿病組創(chuàng)口每個高倍視野的中性粒細胞平均數量大于30，而對照組創(chuàng)口的中性粒細胞平均數量小于20。因此，出現肌成纖維細胞且浸潤的中性粒細胞數量大于30可作為傷后5～10d糖尿病創(chuàng)口的特征，所有的對照組創(chuàng)口及其他傷后時間點的糖尿病組創(chuàng)口都不具備該特征。再根據肌成纖維細胞的具體數量進一步確定傷后5～10d糖尿病創(chuàng)口的確切損傷時間。

此外，本研究選用的DB小鼠從4周齡開始出現持續(xù)的高血糖，未控制血糖水平。因此，對于未進行有效血糖控制的嚴重糖尿病患者的損傷形成時間推斷，本研究的糖尿病組數據可作為相應的參考依據。如果糖尿病患者從發(fā)病初期即有效地控制血糖，其損傷愈合可能更接近于正常損傷的愈合。對于法醫(yī)學實踐應用，仍需收集符合上述情況的糖尿病患者損傷樣本進一步研究。