柳 笛,史文靜,李重文

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系,太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院西院防保科,太原 030053；3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院西院耳鼻喉科,太原 030053)

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉是耳鼻咽喉頭頸外科的一種常見病和多發(fā)病。它以反復(fù)發(fā)作和持續(xù)性黏膜炎癥為主要特征。鼻黏膜作為呼吸道天然免疫的第一道防線，它通過(guò)產(chǎn)生自然抗微生物因子和啟動(dòng)炎性反應(yīng)對(duì)微生物做出反應(yīng)。上皮組織還是產(chǎn)生細(xì)胞因子、化學(xué)因子和其他炎癥因子的重要來(lái)源[1]，其中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在鼻黏膜免疫中的作用越來(lái)越受到人們的重視[2-3]。研究表明，TLRs在人鼻黏膜中有表達(dá)，并且參與了鼻黏膜的免疫防御，對(duì)鼻黏膜抵抗微生物入侵發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。

TLR-8(Toll-like receptor 8)作為TLRs 的成員，主要識(shí)別單鏈RNA，參與病毒感染，其活化的信號(hào)傳導(dǎo)屬于經(jīng)典的Toll樣信號(hào)通路，可介導(dǎo)MyD88依賴型信號(hào)通路，啟動(dòng)NF-κB 途徑和應(yīng)激激酶途徑，最終導(dǎo)致炎性反應(yīng)[5-6]。盡管已有揭示TLRs在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生與發(fā)展中作用的報(bào)道[7]，然而少見有關(guān)TLR-8在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)病過(guò)程中的作用和表達(dá)調(diào)控機(jī)制的報(bào)道。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)，研究鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者下鼻甲鼻黏膜上皮組織和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉黏膜上皮組織中TLR8的表達(dá)情況，探討其在人鼻黏膜上皮組織免疫中的作用，揭示慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年5月至2015年4月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院18例鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者下鼻甲鼻黏膜上皮組織作為對(duì)照組,排除慢性鼻竇炎、過(guò)敏性鼻炎性疾病，其中男11例，女7例，平均年齡(31.0±4.8)歲，再選取50例慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉黏膜上皮組織標(biāo)本作為鼻息肉組，其中男34例，女16例，平均年齡(44.0±6.7)歲。所采用病例術(shù)前經(jīng)臨床癥狀、體征、內(nèi)窺鏡檢查、CT檢查及術(shù)后病理證實(shí)。所有患者排除1周內(nèi)上呼吸道感染、類固醇藥物及抗組胺藥物等應(yīng)用史，標(biāo)本收集前告知患者并取得患者同意及簽署同意書，且本研究方案通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要試劑 小鼠抗人TLR-8多克隆抗體購(gòu)于啟動(dòng)子生物有限公司。免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒與抗體專用稀釋液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)與枸櫞酸鉀緩沖液均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法。鉗取鼻息肉組患者息肉頭端組織；根據(jù)以往文獻(xiàn)中相關(guān)手術(shù)操作方案[8-10]，取同時(shí)行中鼻甲切除術(shù)和鼻中隔偏曲矯正術(shù)的患者中鼻甲頭端距上緣約5 mm處一約3 mm×3 mm大小黏膜組織作為對(duì)照組。取材后固定、包埋。臘塊連續(xù)4 μm切片后置于47 ℃溫水中，選取平整的切片于事先經(jīng)防脫片處理過(guò)的載玻片上攤片、烤片(60～62 ℃) 12～18 h，脫蠟水化后放入3% H2O2，在室溫下孵育10 min，然后用蒸餾水和PBS分別洗滌3次，并用0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)于高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌3次。除去PBS，于室溫下放置25 min后，除去血清加一抗[TLR-8切片加1滴第一抗體 (TLR-8抗體滴度為1∶400)，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，濕盒中4 ℃過(guò)夜]。24 h后加二抗 (PBS沖洗4次，除去PBS，每張切片加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次)。加三抗 (除去PBS，每張切片加l滴鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗)。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片、鏡檢。

1.2.3結(jié)果判定 應(yīng)用BI-2000病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。細(xì)胞染色強(qiáng)度分為：陰性(-)為不著色，弱陽(yáng)性(+)為淡黃色，陽(yáng)性(++)為棕黃色，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為深棕黃色。

1.2.4平均積分光密度值(AIOD)的測(cè)定 每張組織切片于400倍鏡下取5個(gè)陽(yáng)性部位，所取部位均不重疊，在測(cè)量窗標(biāo)準(zhǔn)相同的前提下，經(jīng)校正后測(cè)量位于陽(yáng)性目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的積分光密度值，將所測(cè)的積分光密度值取均值即為AIOD，其值越大表示炎性反應(yīng)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 TLR-8在鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者下鼻甲鼻黏膜上皮組織和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉黏膜上皮組織中均有表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞染色后呈淡黃色到深棕黃色分布，主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜上也有分布。見圖1。

A:對(duì)照組;B:鼻息肉組

圖1 TLR-8在對(duì)照組和鼻息肉組的表達(dá)(×200)

表1 TLR-8在鼻息肉組和對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率[%(n/n)]

2.2AIOD測(cè)定結(jié)果 TLR-8在鼻息肉組中的AIOD為0.52±0.06，而其在對(duì)照組中為0.30±0.05，鼻息肉組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鼻息肉組中TLR-8蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為76.0%(38/50),明顯高于對(duì)照組的27.8%(5/18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討 論

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉具有持續(xù)性黏膜炎癥的特征,天然免疫和獲得性免疫在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。天然免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的識(shí)別涉及模式識(shí)別受體(PRRs)和病原相關(guān)分子模式的相互作用。最廣泛具有特征性的跨膜PRRs是TLRs。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TLRs家族包含11種受體，分別對(duì)不同種類的配體具有特異識(shí)別性[11]。

近年來(lái)，TLRs在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)病機(jī)制中的作用引起了人們廣泛關(guān)注。2012年，LAURIELLO等[12]對(duì)不同類型鼻炎中TLR-4和TLR-9表達(dá)水平的研究發(fā)現(xiàn)，人正常鼻黏膜上皮細(xì)胞中有TLR-4和TLR-9表達(dá)，在變應(yīng)性鼻炎中其表達(dá)顯著下降，然而在慢性鼻-鼻竇炎中TLR-4表達(dá)顯著提高。2013年，夏忠芳等[13]借助免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了兒童慢性鼻-鼻竇炎鼻黏膜組織和正常鼻黏膜組織中TLR-9蛋白的表達(dá)和分布，發(fā)現(xiàn)TLR-9在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均有表達(dá)，且在慢性鼻-鼻竇炎鼻黏膜組織低表達(dá)。MELVIN等[14]發(fā)現(xiàn)囊性纖維化病伴慢性鼻竇炎患者中，TLR-9在鼻黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，TLRs在鼻息肉組織中的表達(dá)也引起了人們極大興趣。2013年，顧兆偉等[15]采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了慢性鼻竇炎鼻息肉組織中TLR-2和TLR-4蛋白的表達(dá)和分布，同時(shí)選取正常篩竇黏膜進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明TLR-2和TLR-4表達(dá)水平可能與慢性鼻竇炎鼻息肉的發(fā)病機(jī)制存在著一定的關(guān)聯(lián)。ZHAO等[16]對(duì)正常鼻黏膜和鼻息肉組織中TLR-9蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)的比較，發(fā)現(xiàn)感染性因素對(duì)鼻息肉發(fā)病有重要影響。汪際云等[17]對(duì)鼻黏膜中TLR-5表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，在所有息肉組織標(biāo)本中均檢測(cè)到TLR-5 mRNA和蛋白表達(dá)，推測(cè)鼻息肉組織中TLR-5表達(dá)的增高可能與鼻息肉內(nèi)持續(xù)的炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。ZHANG等[18]借助基因芯片技術(shù)初步發(fā)現(xiàn)TLR-7在慢性鼻-鼻竇炎細(xì)胞有顯著表達(dá)。總之，盡管人們對(duì)TLRs在慢性鼻-鼻竇炎鼻息肉黏膜上皮組織中的表達(dá)進(jìn)行了大量研究，但對(duì)于人鼻黏膜上皮組織中TLR-8的表達(dá)鮮有報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉黏膜上皮組織中和鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者下鼻甲鼻黏膜上皮組織中均檢測(cè)到的TLR-8的表達(dá)。由于蛋白質(zhì)是機(jī)體生理功能的直接執(zhí)行者，因此，鼻黏膜上皮有TLR-8蛋白行使功能。

本研究顯示，鼻息肉組黏膜上皮組織中TLR-8的AIOD和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組下鼻甲鼻黏膜上皮組織。這一結(jié)果表明在鼻-鼻竇炎伴鼻息肉炎癥過(guò)程中，炎癥刺激能上調(diào)TLR-8在鼻黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)，表明TLR-8可能參與了鼻黏膜上皮細(xì)胞免疫防御性炎性反應(yīng)，參與了鼻黏膜的免疫防御。鼻息肉在遭受病原微生物侵害時(shí)，參與TLR-8相關(guān)的免疫反應(yīng)對(duì)病原微生物的限制和清除能力較強(qiáng)，TLR-8對(duì)鼻黏膜抵抗微生物入侵可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，TLR-8可介導(dǎo)MyD88依賴型信號(hào)通路[5-6]。因此，結(jié)合以往文獻(xiàn)可以推測(cè)，慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉的形成可能是TLR-8的信號(hào)通過(guò)MyD88途徑，引起了NF-κB及各種酶(如蛋白激酶，基質(zhì)金屬蛋白酶-9等)的活化，從而引起了嗜酸性粒細(xì)胞的活化，形成炎癥。同時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞在鼻黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和間質(zhì)細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞的活化下發(fā)生了聚集和間質(zhì)的纖維化的現(xiàn)象，改變了上皮細(xì)胞纖毛系統(tǒng)生物電特性，使鼻黏膜組織內(nèi)環(huán)境遭到破壞，水分和離子代謝失衡，使水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和間質(zhì)中，形成組織水腫，導(dǎo)致鼻息肉發(fā)生和發(fā)展。因此，若能深入研究TLR-8參與鼻黏膜上皮細(xì)胞免疫防御性炎癥慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉反應(yīng)機(jī)制，必將為慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉的免疫治療方向提供更系統(tǒng)的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了TLR-8在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮組織中高表達(dá)，其能在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此，在臨床中測(cè)定TLR-8的表達(dá)，必將有助于慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉的確診與治療。