周鳳高，徐 冕，顏悅新，劉椏名，許 成，蔣國云，趙 琨，武 彧，劉 榮△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院EICU,昆明 650032；2.云南省阜外心血管病醫(yī)院SICU,昆明 650032；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院ICU，廣東深圳 518100)

膿毒癥是由嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后、感染等因素引起的全身炎性反應(yīng)，被定義為威脅生命的嚴(yán)重宿主炎性反應(yīng)，嚴(yán)重時可導(dǎo)致多器官功能障礙，也是導(dǎo)致重癥患者死亡的主要原因之一[1]。目前臨床上仍未發(fā)現(xiàn)一種或者幾種特異性的生物標(biāo)記物用于膿毒癥早期診斷，而診斷及治療越晚的患者病死率越高，相反，盡早的診斷并及時干預(yù)可以明顯提高患者的治愈率[2]。因此，尋找膿毒癥的特異性標(biāo)記物以幫助早期診斷至關(guān)重要。代謝組學(xué)由OLIVER等[3]在1998年最先提出，并于1999年由NICHOLSON等[4]命名為“代謝組學(xué)”，該學(xué)科是對生物體因受外界刺激所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并試圖闡述其代謝規(guī)律[5-6]。在最近的研究中，IZQUIERDO-GARCIA等[7]用定量核磁共振(NMR)代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠的肺組織、肺泡液中的代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化，并認(rèn)為代謝組學(xué)分析方法是診斷膿毒癥的潛在有用技術(shù)。而膿毒癥患者的全身炎性反應(yīng)失控是炎癥因子和炎癥因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)綜合結(jié)果所致[8]。因此本研究通過代謝組學(xué)的方法，試圖尋找膿毒癥的特異性標(biāo)志物及其代謝網(wǎng)絡(luò)的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1動物及實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。氯化鈉注射液(0.9%)，水合氯醛(10%)，碘伏消毒液，無菌剪刀、手術(shù)刀、鑷子、紗布，21G針頭，無菌5-0絲線和圓針。

1.2儀器 高速低溫離心機(jī)(法國Oouan公司)，超低溫保溫箱(中國Forma Scientific公司)，液相色譜277C UPLC System (美國Waters公司),質(zhì)譜SYNAPT G2 XS QTOF(美國Waters公司)等。

1.3膿毒癥模型 SD大鼠術(shù)前1 d禁食，可飲水，大鼠分組做好標(biāo)記。根據(jù)大鼠標(biāo)記，依次行盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)；首先腹腔注射水合氯醛(10%)，注射劑量約為0.4 mg /kg(根據(jù)大鼠麻醉效果可適當(dāng)增減)，麻醉成功后，將大鼠固定于夾板上，腹部備皮，消毒；用手術(shù)刀逐層切開腹部，切口為腹部中下部位，長約1.5 cm；用無菌鑷逐層分開并固定皮膚、肌肉，用濕紗布分開并保護(hù)腹腔腸管，尋找到盲腸并置于濕紗布上。用鑷子鈍性分離盲腸腸系膜末端1 cm處，用5-0絲線結(jié)扎分離部位，結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端長度均為1 cm，約為盲腸的1/2，并用21G針頭穿刺腸壁2 次，針孔間距約3 mm，擠出適量腸內(nèi)容物，然后將盲腸按原位放回腹腔，并逐層縫合腹壁肌肉、皮膚，關(guān)腹后皮下注射氯化鈉注射液(3 mL/100 g)，補(bǔ)充手術(shù)過程中體液的丟失，術(shù)后置于相同環(huán)境中。根據(jù)大鼠標(biāo)記分為A組、B組、C組、D組、E組，分別對應(yīng)在術(shù)前(0 h)，CLP模型建立后6、12、24、48 h采集大鼠股動脈動脈血2 mL，3 000 r/min 離心3 min，收集上清液用于大鼠代謝組學(xué)的檢測，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２赏暄髮⑵涿摼侍幩?，剪開腹部觀察其腹腔臟器變化情況。一般情況觀察發(fā)現(xiàn)：大鼠的麻醉蘇醒時間基本相同，為(60±30)min；各組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)飲食、飲水明顯減少，精神萎靡，蜷縮少動，皮發(fā)無光澤等。按預(yù)設(shè)的時間點(diǎn)采血后，剪刀剪開大鼠腹部，觀察大鼠的腹部變化情況?？梢园l(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)時間越長，腹部缺血、感染情況越明顯(圖1)。根據(jù)大鼠的一般情況變化，以及大鼠腹部情況的變化，可判定大鼠膿毒癥模型復(fù)制成功。

1.4代謝組學(xué)分析

1.4.1實(shí)驗(yàn)流程 為了獲得可靠的數(shù)據(jù)，本項(xiàng)目加入質(zhì)控(QC)樣本來對整個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行監(jiān)控，QC樣本為取等量制備好的實(shí)驗(yàn)樣本混合而成。首先用有機(jī)試劑沉淀蛋白法分別對3組樣本進(jìn)行代謝物提取，其次用液相色譜-質(zhì)譜檢測對代謝物提取液依次進(jìn)行分析，見圖2。

A:術(shù)前；B:CLP模型建立后6 h；C：CLP模型建立后12 h；D:CLP模型建立后24 h；E:CLP模型建立后48 h

圖1 不同時點(diǎn)腹部變化情況

圖2 實(shí)驗(yàn)流程

1.4.1.1代謝物提取方法 取-80 ℃低溫保存的血清樣品(含樣本制備QC),先置于-20 ℃放置30 min，再放置于4 ℃冰箱使之融化，直至樣品內(nèi)看不見冰；用可調(diào)節(jié)間距的排槍，將每個樣品(含QC)各取40 μL(可根據(jù)實(shí)際檢測樣品的情況調(diào)整)，加入相應(yīng)96孔板中，剩余樣品凍存；在已加入40 μL樣品(含QC)的新EP管中加入甲醇120 μL,封膜后振蕩1 min，置于-20 ℃冰箱30 min；4 000 r/min 4 ℃離心20 min；將96孔板從離心機(jī)中取出，每個孔取20 μL置于新的96孔板中，加入180 μL 50%甲醇進(jìn)行稀釋，每個孔取出20 μL置于樣品槽中混合為上機(jī)QC樣本，每個孔取80 μL置于新的96孔板中；用熱封儀對96孔板加蓋鋁膜封口，在膜上用筆注明項(xiàng)目編號及正負(fù)離子，板編號，有蛋白沉淀的板同時封膜后置于-80 ℃保存。

1.4.1.2液相參數(shù)描述 采用液相色譜277C UPLC System (100 mm×2.1 mm，1.7 μm， Waters，USA)進(jìn)行色譜分離，色譜柱柱溫為50 ℃，流速為0.4 mL/min，其中A流動相為水和0.1%甲酸，B流動相為甲醇和0.1%甲酸。對代謝物采用以下梯度進(jìn)行洗脫：0～2 min，100%流動相A；2～11 min，0～100%流動相B；11～13 min，100%流動相B；13～15 min則為100%流動相A。每個樣本的上樣體積為10 μL。

1.4.1.3質(zhì)譜參數(shù)描述 對從色譜柱上洗脫下來的小分子，利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜SYNAPT G2-XS QTOF (美國Waters公司)，分別進(jìn)行正負(fù)離子模式采集。正離子模式下，毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為2 kV和40 V。負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓及錐孔電壓分別為2 kV和40 V。采用MSE模式進(jìn)行Centroid數(shù)據(jù)采集，一級掃描為50～1 200 Da，掃描時間為0.2 s，對所有母離子按照20～40 eV的能量進(jìn)行碎裂，采集所有的碎片信息，掃描時間為0.2 s。在數(shù)據(jù)采集過程中，對LE信號每3 s進(jìn)行實(shí)時質(zhì)量校正。同時，每隔10個樣本進(jìn)行一次混合后QC樣本的采集，用于評估在樣本采集過程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。

1.4.2信息分析流程

圖3 信息分析流程

在獲得下機(jī)數(shù)據(jù)(原始數(shù)據(jù)rawdata)后，依次根據(jù)信息分析流程步驟對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。首先對質(zhì)譜下的機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理；其次用統(tǒng)計分析方法篩選出差異離子；最后對代謝物及差異代謝物進(jìn)行鑒定，并分析其代謝通路。質(zhì)譜下機(jī)原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入商業(yè)軟件 Progenesis QI (version 2.2) 進(jìn)行峰提取，獲得代謝物相關(guān)的質(zhì)荷比、保留時間和離子面積等信息。隨后對提取出來的數(shù)據(jù)去低質(zhì)量離子，采用基于質(zhì)控樣本信息對真實(shí)樣本信號進(jìn)行局部多項(xiàng)式回歸擬合信號[9]方法校正。對校正后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，即將所有QC樣品中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)>30%的離子過濾掉(RSD>30%的離子在實(shí)驗(yàn)過程中波動較大，不納入下游統(tǒng)計學(xué)分析)。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 由于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有“高維、海量”的特點(diǎn)，因此需要用單維和多維的方法根據(jù)數(shù)據(jù)特性從不同角度進(jìn)行分析。本研究采用華大代謝組學(xué)研究團(tuán)隊(duì)自主開發(fā)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析流程，進(jìn)行單變量和多變量分析，從而獲得組間差異代謝物；其方法包括參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)、差異表達(dá)倍數(shù)分析、主成分分析PCA、偏最小二乘法判別分析PLS-DA[10-11]等。

2 結(jié) 果

2.1差異離子篩選及鑒定 根據(jù)信息分析流程，該項(xiàng)目采用多變量分析PLS-DA模型第二主成分的VIP值，結(jié)合單變量分析差異倍數(shù)(fold-change)和q-value值來篩選差異表達(dá)的代謝物。篩選條件:(1)VIP≥1；(2)fold change≥1.2(≤0.833 3)；(3)q<0.05。三者取交集，得到共有的離子即差異離子。差異離子結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組與對照組之間正(pos)、負(fù)(neg)離子模式均出現(xiàn)差異離子，且在24 h即D～A組間差異離子數(shù)最多，此結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥模型下動物體內(nèi)早期6 h即B～A組(甚至更早)就開始出現(xiàn)代謝物的變化，而且在24 h即D～A組左右出現(xiàn)最大變化，見表1。

表1 差異離子鑒定表

一級鑒定數(shù)：通過一級數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)庫后被鑒定的離子數(shù)目；二級鑒定數(shù)：通過數(shù)據(jù)庫的理論二級碎片搜索后被鑒定的數(shù)目

2.3差異代謝物通路分析 根據(jù)篩選出的差異離子，基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物代謝通路查找，通過代謝通路分析能夠幫助了解代謝物所參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最終根據(jù)neg離子模式確定了75條代謝通路，根據(jù)pos離子模式確定了158條代謝通路，其通路主要包含了碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、類固醇類、嘌呤、膽汁酸等代謝通路，且各通路之間相互聯(lián)系。

2.2根據(jù)篩選出來的差異離子做聚類分析 從聚類圖中能更直觀地發(fā)現(xiàn)6 h即B～A組就開始出現(xiàn)差異(甚至更早)，到24 h即D～A組對比差異最明顯，強(qiáng)度最大，見圖4。圖中每一行代表一個差異離子，每一列代表一個樣本，不同顏色代表不同強(qiáng)度，顏色從綠色到紅色表示強(qiáng)調(diào)從低到高。

3 討 論

眾所周知，全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒癥、膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征是同一病理過程的不同階段，終末階段表現(xiàn)為多器官功能障礙綜合征。多器官功能障礙綜合征病死率為50%～60%，它是當(dāng)今危重癥醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，早期診斷、治療，患者的生存率會大大提高[12-13]。膿毒癥動物模型的制作方法眾多，但越來越多的學(xué)者認(rèn)為CLP建型更符合臨床，有學(xué)者把CLP作為膿毒癥模型的金標(biāo)準(zhǔn)等[14]。

代謝組學(xué)主要是通過高通量的實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模的計算，研究分析機(jī)體內(nèi)小分子代謝物的變化規(guī)律，目的是從檢測到的大量代謝物中篩選出具有統(tǒng)計學(xué)和生物學(xué)意義的代謝物，并根據(jù)相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫對代謝物的代謝過程進(jìn)行分析。

膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病死率高，學(xué)者們一直在嘗試尋找診斷膿毒癥的特異性標(biāo)記物，以期早期診斷、治療，降低其病死率。早期的研究發(fā)現(xiàn)：檢測膿毒癥患者血漿中異常表達(dá)的蛋白，可用于膿毒癥的診斷及其預(yù)后的預(yù)測[15]。而有研究則利用代謝組學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠的心臟、肝臟及大腦中均有多種異常蛋白的表達(dá)[16-18]；IZQUIERDO-GARCIA等[7]同樣利用代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠的肺組織、肺泡液中的代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化，并認(rèn)為代謝組學(xué)分析方法可用于診斷膿毒癥；近年來，XU等[19]利用代謝組學(xué)方法確定了6種脂肪酸用于評估膿毒癥的預(yù)后。然而，由于膿毒癥發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，參與代謝的代謝物及代謝途徑也非常復(fù)雜，因此膿毒癥不可能只用1個或2個生物標(biāo)志物可以診斷的。所以，筆者嘗試一種基于整體代謝譜的預(yù)測方法來識別膿毒癥早期特異性代謝物，并闡明其在膿毒癥中的病理生理過程及代謝途徑。

本研究中發(fā)現(xiàn)不同時間組之間neg、pos離子模式均出現(xiàn)差異離子，在CLP模型建立后6 h即B-A組(甚至更早)就開始出現(xiàn)明顯差異，且在24 h即D-A組差異離子數(shù)最多。膿毒癥時機(jī)體發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，主要包括內(nèi)皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞因子及炎癥因子釋放、線粒體功能障礙、脂質(zhì)過氧化、DNA的損傷、自由基失衡、氧化抗氧化失衡等[20]。當(dāng)機(jī)體受到各種病理或生理刺激時機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體主要表現(xiàn)為“高代謝”，因此分泌大量應(yīng)激激素，如兒茶酚胺、胰高血糖素、甲狀腺素等，此時機(jī)體能量需求明顯增加，促使大量能源物質(zhì)消耗、肌肉蛋白分解，故能量代謝出現(xiàn)紊亂；膿毒癥時機(jī)體逐漸出現(xiàn)缺血缺氧[21]，線粒體氧化功能出現(xiàn)障礙，機(jī)體“氧債”增加，乳酸、酮體產(chǎn)生增加；當(dāng)出現(xiàn)膿毒血癥時機(jī)體全身炎性反應(yīng)、血液中炎性介質(zhì)及激素水平等升高，從而導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)一步引起碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和核酸等代謝物變化的紊亂[22-24]。因此膿毒癥時機(jī)體可出現(xiàn)一系列差異性代謝物。本研究中發(fā)現(xiàn)neg離子模式差異離子共4 324個，pos離子模式共4 053個，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫，其根據(jù)neg離子模式確定了75條代謝通路，根據(jù)pos離子模式確定了158條代謝通路，其代謝通路主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、類固醇類、嘌呤、膽汁酸等，說明膿毒癥是一個極其復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，涵蓋了機(jī)體各個系統(tǒng)的生理反應(yīng)，并相互影響。

本研究尚有以下方面需進(jìn)一步探討：(1)仍需較大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證其共同代謝物及其代謝通路；(2)可進(jìn)一步研究分析各個時間段代謝物及其代謝通路，并分析其病理生理過程；(3)因膿毒癥病理生理極其復(fù)雜，因此膿毒癥發(fā)生時的代謝物及其代謝通路眾多，如需找到特異性標(biāo)記物，還需要大量的研究對比分析。

總之，代謝組學(xué)對膿毒癥的研究分析及診斷有重要意義。本研究利用代謝組學(xué)方法研究了膿毒癥的不同階段，發(fā)現(xiàn)的一些潛在的分子代謝產(chǎn)物及其相關(guān)的代謝途徑可能成為今后膿毒癥代謝途徑研究的重要線索。