宿曼筠，王友蘭，吳愛英

（山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071）

姜棗祛寒顆粒由干姜和大棗組方，功效為發(fā)散祛寒、和胃溫中，用于風(fēng)寒感冒、胃寒疼痛?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊）》［1］，其中僅有干姜對照藥材的鑒別，且涉及揮發(fā)性較大的有害試劑苯及易制毒試劑乙醚。為了更全面地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本研究中增加了6-姜辣素對照品及大棗對照藥材的薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對干姜的有效成分6-姜辣素進(jìn)行了方法學(xué)考察和含量測定。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；Auto Science AS10200BT型超聲波清洗器（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；ZF7-C型三用紫外分析儀（上海康華生化儀器制造有限公司）；Si60型硅膠板默克化工技術(shù)＜上海＞有限公司，批號(hào)為HC39961356，規(guī)格為10 cm×20 cm）。

1.2 試藥

6-姜辣素對照品（批號(hào)為111833-201303），干姜對照藥材（批號(hào)為120942-201510），大棗對照藥材（批號(hào)為121040-201408），均購自中國食品藥品檢定研究院；姜棗祛寒顆粒（廠家HRSJ、廠家SXHK、廠家ZTJD，共11批，規(guī)格為每袋15 g）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

干姜：取本品5 g，研細(xì)，加二氯甲烷-甲醇（2∶1）20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至干，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取干姜對照藥材0.5 g，同法制備對照藥材溶液。再取6-姜辣素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例和制法制得不含干姜的樣品，按供試品溶液制備方法制得干姜陰性對照溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯 -甲醇-冰醋酸（20∶3∶2∶0.4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光及紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 干姜薄層色譜圖

大棗：取大棗對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，實(shí)時(shí)補(bǔ)充減失的水分，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄?甲醇（2∶1）20 mL，按干姜鑒別項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按處方比例和工藝制得不含干姜的樣品，按干姜鑒別項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得大棗陰性對照溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502中TLC法試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

圖2 大棗薄層色譜圖

色譜柱：Accurasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -甲醇 -0.1%磷酸溶液（40∶5∶55）；檢測波長：280nm；流速：1.0mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按6-姜辣素峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取6-姜辣素對照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，混勻，作為對照品貯備液，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，即得。

供試品溶液：取樣品10袋，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為100 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液：按處方比例及工藝配制缺干姜的陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果在對照品溶液色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間處，陰性對照溶液無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性對照無干擾。結(jié)果見圖3。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取上述對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.023 1 g／L）2，5，10，15，25 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得6-姜辣素回歸方程Y＝585 443X-1 194.4，r＝1（n＝5）。結(jié)果表明，6-姜辣素進(jìn)樣量在46～578 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

圖3 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值。結(jié)果的RSD為0.30%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150108）適量，依法制備供試品溶液，分別于 0，2，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣分析，測定峰面積積分值。結(jié)果的RSD為0.38%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150108），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定。結(jié)果平均含量為每袋 1.40 mg，RSD為 1.40%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為150108），研細(xì)，稱取約 2.50 g，共 6 份，精密稱定，精密加入對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.011 5 g／L）20 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.2.4 耐用性試驗(yàn)

流動(dòng)相比例考察：以乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，對流動(dòng)相的比例稍加調(diào)整，進(jìn)行分析。結(jié)果見表2?？梢?，流動(dòng)相中乙腈用量減少，6-姜辣素的保留時(shí)間有所延長，含量未發(fā)生變化，流動(dòng)相組成比例的適量變化不影響結(jié)果。

表2 流動(dòng)相比例考察結(jié)果（n＝2）

色譜柱考察：選用3種不同的色譜柱，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，測定6-姜辣素的峰面積。結(jié)果6-姜辣素平均含量為每袋 1.42 mg，RSD為 0.70% （n＝2），表明不同色譜柱對結(jié)果影響較小。

2.2.5 樣品含量測定

2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算其含量。結(jié)果見表4。

表3 色譜柱耐用性試驗(yàn)結(jié)果（n＝2）

表4 各批樣品的含量測定結(jié)果（mg／袋）

3 討論

3.1 干姜定性鑒別的修訂

原標(biāo)準(zhǔn)［1］中提取溶劑乙醚屬易制毒試劑，改用二氯甲烷-甲醇（2∶1）提取溶劑毒性較小，且可同時(shí)適用于干姜和大棗的鑒別，既簡化了操作步驟，又節(jié)約了溶劑，因此選用此系統(tǒng)為提取溶劑。原標(biāo)準(zhǔn)使用1 g對照藥材，供試品取樣量折算干姜的用量約為0.4 g，結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，將干姜對照藥材的用量由原標(biāo)準(zhǔn)的1 g改為0.5 g。原標(biāo)準(zhǔn)及2015年版《中國藥典（一部）》干姜藥材TLC展開劑［2］14使用了毒性較大的苯和三氯甲烷有機(jī)試劑，為了遵循綠色環(huán)保的理念，經(jīng)試驗(yàn)比較多個(gè)展開系統(tǒng)，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（20 ∶3 ∶2 ∶0.4）為展開劑分離效果良好、試劑毒性較小，隨行陰性樣品無干擾，故選用此展開劑系統(tǒng)。本研究中對方法的耐用性進(jìn)行了考察，使用3種不同品牌的硅膠板展開：Si60（默克化工技術(shù)有限公司，批號(hào)為HC39961356，規(guī)格為10cm×20cm）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)為20161220，規(guī)格為200mm×100mm）；自制硅膠G薄層板，取硅膠G（青島海洋化工廠，化學(xué)純，批號(hào)為20161220）加0.5%羧甲基纖維素鈉溶液調(diào)配，用手動(dòng)鋪板器鋪成厚度為0.25 mm的薄層板，室溫晾干，110℃活化1 h，置硅膠干燥器中備用。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，說明方法的專屬性、耐用性較好。

3.2 大棗定性鑒別考察

嘗試采用2015年版《中國藥典（一部）》大棗藥材TLC鑒別方法［2］22發(fā)現(xiàn)，本制劑中的陰性對照有干擾；由于大棗中主要含有多糖［3］等成分，對供試品的提取方法進(jìn)行了更換溶劑及水解［4-7］等多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)供試品溶液不穩(wěn)定且陰性對照仍有干擾。大棗中含有齊墩果酸等多種有機(jī)酸與多種氨基酸類成分［3］，結(jié)合本制劑的工藝，經(jīng)過多方試驗(yàn)，最終選用正丁醇-醋酸-水系統(tǒng)［8］作為展開劑，茚三酮試液為顯色劑，顯色斑點(diǎn)清晰，穩(wěn)定性與重復(fù)性均良好，陰性無干擾。本研究中對方法的耐用性進(jìn)行了考察，在上述3種不同硅膠板展開后，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，說明方法專屬性、耐用性好。

3.3 6-姜辣素含量測定條件選擇

干姜中最主要的辛辣成分為姜辣素，以6-姜辣素含量最大［9］。參考 2015 年版《中國藥典 （一部 ）》干姜項(xiàng)下的含量測定項(xiàng)，對處方中干姜的6-姜辣素的含量采用HPLC法進(jìn)行考察。本研究中對提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行了考察，試驗(yàn)結(jié)果表明，70%乙醇超聲提取20 min即可完全提??；并考察了甲醇 - 水（62 ∶38）［10］、甲醇 -水（55 ∶45）［11］和乙腈 -甲醇 -水（40 ∶5 ∶55）3 種流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-姜辣素的峰型有拖尾現(xiàn)象，對流動(dòng)性稍加改進(jìn)，采用乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶5∶55）流動(dòng)相，峰型較好，拖尾因子為 1.0。