徐豪杰，周建超，楊文輝

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院藥學部，河南 鄭州 450052)

丹參具有活血、調(diào)經(jīng)、止痛、祛瘀等功效。研究[1-2]顯示，丹參中含有數(shù)百種化學成分，主要分為水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類。丹參酮類是丹參的特征性成分之一，包括丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ等多種。其中丹參酮ⅡA和丹酚酸B被選為國家藥典中丹參質量控制的指標性成分，具有明顯的心血管保護作用。研究[3]發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮I等多種丹參酮類均具有抗腫瘤活性。目前關于隱丹參酮的研究較少，本實驗主要研究隱丹參酮對宮頸鱗癌Siha細胞的細胞毒性作用的影響，初步探討其抗腫瘤作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料宮頸鱗癌細胞株Siha，由北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心提供；隱丹參酮，由中國食品藥品檢定研究院提供，純度為98%。

試劑與儀器：高糖型DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；四氮唑噻唑藍(MTT)，上海生物工程有限公司；牛血清，美國Gibco公司；鼠抗人E6、P53、P21、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗，美國Santa Cruz公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；LX-800型酶聯(lián)免疫檢測儀，日本Epson公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；凝膠成像分析儀，瑞典Pharmacia公司；流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Siha細胞常規(guī)培養(yǎng)在含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)5% CO2及相對飽和濕度。孵育2～3 d后用質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代,選對數(shù)生長期的Shia細胞進行試驗。

1.2.2 MTT法測定隱丹參酮對Siha細胞的抑制作用 選取對數(shù)生長期的Shia細胞，用質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加無血清DMEM培養(yǎng)基，以細胞濃度3×103個/孔接種于96孔板，每孔培養(yǎng)基總體積為200 μL；空白對照組給予相同體積的磷酸鹽緩沖液；給藥組分別加入不同濃度的隱丹參酮(0.1、1、5、10、100 μmol·L-1)，每個濃度設6個復孔。分別培養(yǎng)4、8、12、16、20、24 h后，加入5 g·L-1的MTT(20 μL/孔)4 h后，吸去上清加入DMSO 150 μL/孔，微型震蕩器震蕩10 min，使其完全混勻溶解結晶，在酶標儀上于492 nm處測吸光度，每個濃度設平行重復6孔，實驗重復3次。按以下公式計算抑制率，擬合后求IC50值。細胞增殖抑制率=(1-A試驗組/A對照組)×100%。

1.2.3 細胞周期及凋亡的測定 取對數(shù)期生長的Siha細胞以1.0×105個/mL的細胞濃度接種于6孔板,分別設有空白對照組、給藥組(12、24、36、48 h)；隱丹參酮給藥濃度為(1、10、25 μmol·L-1)；空白對照組給予相同體積的磷酸鹽緩沖液。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化，離心(1 000 r·min-1，5 min)，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用體積分數(shù)70%冷乙醇使細胞懸浮固定，置于4 ℃冰箱中保存30 min，-20 ℃過夜。經(jīng)核糖核酸酶消化，碘化丙啶染色，4 ℃避光染30 min后流式細胞儀監(jiān)測分析，重復實驗3次。2 h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞周期分布，計算細胞增殖指數(shù)[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%]。

1.2.4 Western blot法檢測細胞蛋白 隱丹參酮給藥后，收集對數(shù)生長的Siha細胞，加入細胞裂解液，冰上放置15 min, 12 000 r·min-1離心15 min，取上清，以Bradford法作蛋白定量后置-80 ℃貯存?zhèn)溆谩９嘀瀑|量分數(shù)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳、轉膜、封閉。一抗(1500)，4 ℃孵育過夜，二抗(15 000)，室溫孵育2 h，增強化學發(fā)光法顯色。GAPDH檢測作為內(nèi)對照，進行細胞間蛋白表達的比較。

2 結果

2.1 隱丹參酮對Siha細胞增殖的抑制作用不同濃度(0.1、1、5、10、100 μmol·L-1)的隱丹參酮給藥4、8、12、16、20、24 h后, 對Siha細胞的生長呈明顯抑制作用。不同濃度(0、1、1、5、10、100 μmol·L-1)的隱丹參酮對Siha細胞的細胞毒性作用有明顯劑量和時間依賴性。見圖1。

2.2 隱丹參酮對Siha細胞的細胞周期及早期凋亡的影響與空白對照組比較,各給藥組Siha細胞生長產(chǎn)生G0/G1期阻滯，S期所占比例隨給藥時間的延長不斷減少，且隨著給藥時間的增加抑制作用更加明顯。見圖2。

圖1 不同濃度隱丹參酮作用不同時間后對Siha細胞的抑制作用

圖2 不同濃度隱丹參酮作用不同時間后Siha細胞生長周期變化

2.3 隱丹參酮對Siha細胞的相關蛋白表達的影響隨著隱丹參酮(25 μmol·L-1)作用時間的延長，Siha細胞E6蛋白水平表達逐漸降低，P53和P21的蛋白水平表達逐漸升高。見圖3。

圖3 隱丹參酮(25 μmol·L-1)作用不同時間后Siha細胞相關蛋白表達情況

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)展中國家的發(fā)病率及其導致的死亡率均高于發(fā)達國家[4]。與其他惡性腫瘤比較，宮頸癌多發(fā)病于中年女性[5]，一旦患病給患者及其家庭帶來極大痛苦和威脅。

隱丹參酮屬于丹參的脂溶性成分，具有菲醌結構，其中菲環(huán)結構可與DNA結合，而呋喃環(huán)和醌類結構可產(chǎn)生自由基，引起DNA損傷，從而抑制腫瘤細胞DNA合成[6]。丹參酮通過抑制抗增殖細胞核抗原和細胞增殖相關的基因表達發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。

細胞凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切關系，部分抗腫瘤藥物作用的強弱與其誘導腫瘤細胞凋亡的活性呈正比。誘導腫瘤細胞凋亡成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新思路，以及評價療效的新指標[8]。有研究[9]認為大多化療藥物可以引起腫瘤細胞特定靶成分的損傷或功能喪失，從而引起細胞周期阻滯及進入細胞凋亡。

目前，許多分化誘導劑能抑制腫瘤細胞生長，誘導其分化，這主要是由某些癌基因及抑癌基因的表達抑制、失活和活化所致，其作用機制可能是通過抑制細胞原癌基因、誘導抑癌基因的表達，阻滯細胞進入S期及其DNA合成，從而誘導腫瘤細胞分化[10]。本實驗通過MTT法研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的隱丹參酮對Siha細胞的細胞毒性作用有明顯劑量和時間依賴性;流式細胞儀檢查表明，隱丹參酮對Siha細胞的細胞周期有明顯的阻滯，在抑制Siha細胞增殖的同時，可以誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，降低S期細胞比例，減慢腫瘤細胞的增殖速度，抑制DNA的合成并加速誘導細胞凋亡。DNA損傷后，P53或Mdm-2磷酸化，從而上調(diào)P21表達，導致細胞周期阻滯，進而促進DNA修復或細胞凋亡[11]。感染了人乳頭瘤病毒(HPV)的宮頸癌細胞中P53的降解是通過E6蛋白介導的泛素化途徑來實現(xiàn)的，正常P53功能被E6蛋白所破壞[12]。P21基因是P53的效應基因。本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能夠顯著抑制HPV E6蛋白水平的表達，同時Western blot法發(fā)現(xiàn)P53蛋白表達增加，進而誘導其下游的P21蛋白表達增加。

綜上所述，隱丹參酮能明顯抑制宮頸鱗癌Siha細胞的增殖，這與其抑制HPV E6蛋白的表達，使P53和P21的蛋白表達逐漸升高，P53功能恢復并啟動凋亡，從而誘導Siha細胞凋亡有關。但其具體作用機制還需進一步的研究證實。