韓艷玲，周夢良，王漢東

0 引 言

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，約占膠質(zhì)瘤的51.2%，是成人中最常見的膠質(zhì)瘤［1-2］。GBM具有預(yù)后差、致死率高、易復(fù)發(fā)的特點，自出現(xiàn)癥狀到就診大部分在3個月以內(nèi)，6個月內(nèi)病死率高達70%～80%［3］。GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)、放療、化療和聯(lián)合治療，但其中位生存期不足15個月［4］。因此急需尋找一種新的治療策略，以達到更好的治療目的。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 bp的非編碼RNA，近幾年已成為腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點。大量研究證實lncRNA在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的放化療耐性等生理病理過程中發(fā)揮了重要的作用，如lncRNA OR3A4促進了乳腺癌細(xì)胞的增值和遷移［5］，lncRNA SNHG20可促進骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［6］，肝癌和肺癌中也有大量相關(guān)lnc RNA功能和作用機制的報道等［7-8］。本研究前期發(fā)現(xiàn)，lncRNA MTHFD2在GBM組織與正常腦組織中的表達有明顯差異，但其在腫瘤尤其是GBM的生物學(xué)功能目前尚不清楚。本研究旨在探討lncRNA MTHFD2基因在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中的表達情況，并觀察下調(diào)其表達對GBM細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收取2017年9月至2017年12月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)切除的9例GBM患者標(biāo)本，同時取其配對的瘤旁組織（距離膠質(zhì)瘤切緣＞5 cm，且經(jīng)病理組織學(xué)證實無癌細(xì)胞）作為正常對照組織。患者均是首次接收手術(shù)治療，且在手術(shù)之前未經(jīng)過放療、生物治療及化療。GBM組織標(biāo)本以世界衛(wèi)生組織于2007年制定的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類和分級為標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅱ級2例、Ⅲ級4例、Ⅳ3例，并在組織切除后立即放入液氮中冷凍保存。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2017006），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞系與主要試劑膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U-87MG、U251、U-118MG購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，人星型膠質(zhì)細(xì)胞系（Human Astrocytes，HA）購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，U251替莫唑胺（TMZ）耐藥細(xì)胞系（U251/TR）購于上海吉凱基因科技有限公司。LV-MTHFD2-shRNA慢病毒構(gòu)建與上海吉凱基因科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于加拿大維森特公司，AM培養(yǎng)基購于ScienCell。qRTPCR相關(guān)試劑購于日本TaKaRa公司，細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8）購于日本同仁公司，TMZ購于美國sigma公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染A172、U-87MG、U251、U-118MG均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，U251/TR采用含 200 μg/mL TMZ的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HA細(xì)胞用AM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期的U251和U-87MG細(xì)胞，按1×105個/孔濃度接種于6孔板，每種細(xì)胞24 h后分別加入LV-MTHFD2-shRNA病毒液（U251shRNA組、U-87MGshRNA組）和空載LV-control病毒液（U251對照組、U-87MG對照組），MOI=50及終濃度為5 mg/L的Polybrene。感染24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。

1.4 RNA提取及qRT-PCR檢測按照TRIzol說明書操作，分別提取組織和細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行qRT-PCR擴增檢測。MTHFD2上游引物序列為5′-GATCCTGGTTGGCGAGAATCC-3′，下游引物序列為5′-TCTGGAAGAGGCAACTGAACA-3′；內(nèi)參ACTIN的上游引物為5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游引物為5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′。擴增條件為預(yù)變性95℃ 10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析相對表達量。

1.5 細(xì)胞增殖檢測（CCK-8法）將感染病毒的對數(shù)生長期U251和U-87MG細(xì)胞按2×103個/孔接種96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，共5組，同時設(shè)置空白對照為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，每24 h在相應(yīng)地培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK-8檢測試劑，37℃孵育1 h，酶標(biāo)儀上測定450 nm處的吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，時間（第1、2、3、4天）為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測（Transwell小室法）將感染慢病毒的對數(shù)生長期細(xì)胞U251和U-87MG分別以5×104個/孔接種于孔徑為8 μm的Transwell小室中，上層小室培養(yǎng)液為含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，下層小室為含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱放置24 h后，將上室取出，培養(yǎng)基吸盡，棉簽將上層細(xì)胞擦拭干凈，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水清洗20 min后，用結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下分別計數(shù)5個視野的穿膜細(xì)胞均數(shù)。

1.7 細(xì)胞耐藥性測定將感染細(xì)胞按5×103個/孔接種96孔板中，每孔設(shè)3個對照，24 h后加入化療藥物替莫唑胺，濃度分別為：40、100、200、300、400、500 μg/mL，37℃孵育24 h，酶標(biāo)儀上測定450 nm處的吸光度，計算細(xì)胞抑制率，公式如下：

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均值比較采用獨立樣本t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA MTHFD2在GBM組織和各種細(xì)胞系中的表達GBM組織lncRNA MTHFD2相對表達量明顯高于正常對照組織［（5.13±3.96）vs（1.27±0.58）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。U251的lncRNA MTHFD2表達量較HA、A172、U-118MG、U-87MG明顯升高，U-87MG較HA、A172、U-118MG明顯升高（P＜0.05）。見表1。提示lncRNA MTHFD2可能參與GBM的發(fā)生發(fā)展及其耐藥過程。

表1 GBM各細(xì)胞系lncRNAMTHFD2相對表達量比較（±s）Table 1 Relative expression of lncRNA MTHFD2 in different glioblastoma cell lines（±s）

表1 GBM各細(xì)胞系lncRNAMTHFD2相對表達量比較（±s）Table 1 Relative expression of lncRNA MTHFD2 in different glioblastoma cell lines（±s）

兩兩細(xì)胞系之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

F D 2相對表達量U 2 5 1 U 2 5 1/T R 3±0.1 1 9±0.5 2 4±0.2 6 8±0.3 5 1 4.2 3±1.0 2 4 0.0 0±7.7 7

2.2 LV-MTHFD2-shRNA病毒感染的抑制作用U251和U-87MG細(xì)胞感染病毒72 h后，熒光顯微鏡下均可見大量攜帶綠色熒光的細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示，與U251對照組MTHFD2相對表達量（1.02±0.08）比較，U251shRNA組（0.05±0.01）明顯降低（P＜0.01）；與U-87MGs對照組MTHFD2相對表達量（1.04±0.13）比較，U-87MGshRNA組（0.08±0.03）明顯降低（P＜0.01）。說明lncRNA MTHFD2具有干擾作用。

2.3 lncRNA MTHFD2表達下調(diào)對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響U251shRNA組穿過Transwell微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)量與U251對照組比較顯著降低［（41.4±6.99）個/視野vs（125.8±25.27）個/視野］，U-87MGshRNA組穿過Transwell微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)量較U-87MG對照組顯著降低［（113.2±13.67）個/視野vs（182.4±6.88）個/視野］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果示lncRNA MTHFD2下調(diào)明顯降低GBM細(xì)胞U251和U-87MG的遷移能力。見圖1。

2.4 lncRNA MTHFD2表達下調(diào)對細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8結(jié)果顯示，在第4天，U251shRNA組A值較U251對照組顯著降低［（1.85±0.09）vs（3.02±0.26）］，U-87MGshRNA組A值較U-87MG對照組顯著降低［（1.64±0.06）vs（2.17±0.20）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.5 lncRNA MTHFD2對細(xì)胞耐藥性的影響U251shRNA組細(xì)胞抑制率明顯低于U251對照組，U87-MGhRNA組細(xì)胞抑制率亦明顯低于U87-MG對照組（P＜0.05）。見圖3。

圖1 顯微鏡下lncRNA MTHFD2的表達對U251和U-87MG細(xì)胞遷移的影響（×200）Figure 1 Effects of lncRNA MTHFD2 on the migration of U251 and U-87MG cells（×200）

圖2 lncRNA MTHFD2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U-87MG增殖活性的影響Figure 2 Effect of lncRNA MTHFD2 on the proliferation of glioblastoma cells detected by CCK-8 assay

圖3 lncRNA MTHFD2對GBM細(xì)胞U251和U87-MG耐藥性的影響Figure 3 Effect of lncRNA MTHFD2 on the chemoresistance of glioblastoma U251 and U87-MG cells detected by CCK-8 assay

3 討 論

有研究顯示，人類基因組DNA序列不能完全解釋遺傳信息的傳遞問題以及疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制［9］。因此，在后基因組研究時代，研究者逐漸轉(zhuǎn)向ncRNAs。ncRNA主要包括核內(nèi)小RNA、核仁小RNA、微小RNA、干擾小RNA、lncRNA等。與干擾小RNA和微小RNA相比，lncRNA具有靶向識別的特異性，可以折疊成更高級的結(jié)構(gòu)，有助于染色質(zhì)的重塑以及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控［10］。多項研究表明，lncRNA表達失調(diào)與細(xì)胞分化、腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲等密切相關(guān)［11-15］。ncRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究已成為腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的熱點研究話題［11-15］。

近年來，有研究顯示lncRNA與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系。Bian等［16］研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR在膠質(zhì)瘤中有明顯高表達，可通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1促進miR-141啟動子的甲基化，從而抑制紡錘體和激酶相關(guān)復(fù)合亞單位2的表達，最終導(dǎo)致腫瘤增殖。Wang等［17］研究顯示，lncRNA CRNDE過表達可以通過mTOR信號傳導(dǎo)路徑促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，促進GBM細(xì)胞侵襲與遷移，而CRNDE的敲除可抑制致癌基因的活性和功能。除此之外，尚有一些lncRNA如MTHFD2已被發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展可能存在一定聯(lián)系，但其具體功能尚不清楚［18］。

本研究首先驗證了lncRNA MTHFD2在GBM組織和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達情況，結(jié)果與前期的發(fā)現(xiàn)趨勢相一致。尤其是在U251和U-87MG細(xì)胞系中表達較高，同時發(fā)現(xiàn)lncRNA MTHFD2在U251耐藥細(xì)胞系（U251/TR）中的表達也異常增高。因此本研究選取U251和U-87MG細(xì)胞作為研究對象，通過下調(diào)lncRNA MTHFD2表達，探討其在GBM的發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用。本研究應(yīng)用包含lncRNA MTHFD2干擾RNA的慢病毒感染U251和U-87MG細(xì)胞，進而下調(diào)MTHFD2的表達，結(jié)果顯示lncRNA MTHFD2表達下調(diào)，可導(dǎo)致GBM細(xì)胞的遷移和增值能力明顯下降，耐藥指數(shù)也明顯降低，表明lncRNA MTHFD2可能作為促癌因子參與GBM的發(fā)生和發(fā)展，其表達下調(diào)后GBM細(xì)胞生物學(xué)特性的改變提示lnc RNA MTHFD2可能作為GBM潛在的治療靶標(biāo)。本研究在細(xì)胞水平初步證實lnc RNA MTHFD2作為GBM促癌因子的潛質(zhì)。下一步將通過裸鼠成瘤實驗，將在整體水平進一步驗證lnc RNA MTHFD2在GBM的發(fā)生發(fā)展過程的作用，并明確其作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療靶標(biāo)的可行性。

綜上所述，本研究顯示lncRNA MTHFD2在GBM細(xì)胞中的表達下調(diào)可降低細(xì)胞的增殖和遷移能力，增強對化療藥物替莫唑銨的敏感性，提示其可能為GBM潛在的治療靶標(biāo)。