林小聰，陳小誼，余華軍，蘭柳波，符偉玉

0 引 言

蛋白編碼基因在人類基因組上僅占全部基因組序列的1.5%～2%，其他的非編碼基因在轉錄后生成大量的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）分子［1］。根據(jù)其轉錄本長度，ncRNA可分為短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）兩大類［1-2］。lncRNA是片段長度＞ 200個核苷酸的一類內(nèi)源性單鏈RNA分子，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力［2］。研究表明，lncRNA在胃癌中存在廣泛的表達失調(diào)；多種lncRNA可作為癌基因或抑癌基因在胃癌發(fā)病機制中起重要作用，可能成為胃癌潛在的診斷標志物和治療靶點［1-2］。

既往研究利用lncRNA芯片從胃癌患者的癌組織及其配對癌旁組織樣本中篩選出大量差異表達的lncRNA分子；發(fā)現(xiàn)其中一種lncRNA BC002811在胃癌組織中呈明顯的表達上調(diào)［3］。短發(fā)夾結構RNA（short hairpin RNA，shRNA）是根據(jù)小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）序列設計合成的一種具有緊密發(fā)夾環(huán)結構的RNA分子，其所介導的基因沉默效果強于siRNA。但目前尚無相關研究報道shRNA載體所介導的BC002811沉默效應。為了闡明BC002811在胃癌中的生物學功能及其作用機制，本研究構建靶向干擾BC002811的重組慢病毒載體，并篩選出穩(wěn)定低表達BC002811的SGC-7901細胞株，為后續(xù)的功能實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料pLVX-shRNA2載體（美國Clontech公司），慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0（廣州萊德聯(lián)康生物科技有限公司），慢病毒的包裝細胞HEK293T、胃癌SGC-7901細胞（由本實驗室保存），DH5α感受態(tài)細胞（北京鼎國昌盛生物技術有限公司），DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司），Trizol試劑、Lipofectamine?RNAiMAX、LipofectamineTM2000、Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI（上海碧云天生物技術有限公司），T4 DNA連接酶（日本TaKaRa公司），高純質(zhì)粒小量提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司），DNA凝膠回收試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司），M-MLV反轉錄酶（美國Promega公司），qPCR試劑盒（美國Invitrogen公司），MTS試劑（美國Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人胚腎HEK293T細胞使用DMEM完全培養(yǎng)基，人胃腺癌SGC-7901細胞使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。DMEM和RPMI-1640完全培養(yǎng)基均含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

1.2.2 siRNA轉染SGC-7901細胞SGC-7901細胞接種于6孔板中，2×105/孔，待細胞融合度達到40%～50%時，加入Lipofectamine?RNAiMAX以及100 nmol/L針對BC002811的siRNA序列（SIGMA公司合成）進行細胞轉染。實驗根據(jù)不同BC002811 siRNA轉染SGC-7901細胞分為siRNA-1組（siRNA-1正義鏈及反義鏈）、siRNA-2組（siRNA-2正義鏈及反義鏈）、siRNA-3組（siRNA-3正義鏈及反義鏈）、對照組（siRNA-NC正義鏈及反義鏈），取SGC-7901細胞內(nèi)對BC002811表達抑制效果最明顯的siRNA序列構建shRNA，定義為shRNA組。干擾BC002811表達的siRNA序列如下：siRNA-1正義鏈：5′-CUCCUGACCUCAGUUCAUCTT-3′，siRNA-1反義鏈：5′-GAUGAACUGAGGUCAGGAGTT-3′；siRNA-2正義鏈：5′-GAAUAUUGAGGGACAGAAATT-3′，siRNA-2反 義 鏈：5′-UUUCUG UCCCUCAAUAUUCTT-3′；siRNA-3 正 義 鏈 ：5′-CUACCAUCAUACCUGGCU ATT-3′，siRNA-3 反 義 鏈 ：5′-UAGCCAGGUAUGAUGGUAGTT-3′；siRNA-NC 正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，siRNA-NC反義鏈：5′-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測Trizol法提取SGC-7901細胞總RNA；按M-MLV反轉錄酶說明書進行反轉錄反應，合成cDNA；qPCR檢測細胞內(nèi)BC002811的表達水平，內(nèi)參照為U6 snRNA。qPCR所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。BC002811 上 游 引 物 ：5′-GATGAGAAAGCCAAGTTCCA-3′，下游引物：5′-GGTTGACAATCAGTATGGAC-3′；U6 snRNA上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60°C 退火及延伸60 s，40個循環(huán)。應用2－△△Ct法計算BC002811的相對表達水平。

1.2.4 BC002811 shRNA慢病毒載體的構建及鑒定取SGC-7901細胞內(nèi)對BC002811表達抑制效果最明顯的siRNA序列，按照“BamHⅠ酶切位點＋siRNA正義鏈＋Loop環(huán)序列＋siRNA反義鏈＋EcoRⅠ酶切位點”的原則進行BC002811的shRNA基因序列設計。構建慢病毒載體的shRNA基因序列如下：BC002811 shRNA正義鏈：5′-GATCCCTCCTGACCTCAGTTCATCTCAAGAGGATGAACTGAGGTCA GA GTTTTTTTG-3′，BC002811 shRNA 反 義 鏈 ：5′-AATTCAAAAAAACTCCTGACCCAGTTCATCCTCTTGAGATGAACTGAGGTCAGGAGG-3′；shRNA-NC正義 鏈 ：5′-GATCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAATTTTTTTG-3′，shRNA-NC反義鏈：5′-AATTCAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′。shRNA基因序列正義鏈和反義鏈由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。取等體積的正義鏈與反義鏈混合，沸水浴煮沸5 min，72℃保溫15 min，然后室溫自然冷卻，即可獲得雙鏈的shRNA基因序列，定義為shRNA組。使用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對pLVX-shRNA2載體進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后利用T4 DNA連接酶將其與shRNA基因序列，于16℃連接反應2 h，之后轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。搖菌后，將感受態(tài)細胞接種到LB瓊脂培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）上，37℃倒置培養(yǎng)16 h。挑選抗性菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒進行核酸測序鑒定。

1.2.5 重組慢病毒包裝及滴度測定利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將BC002811的重組慢病毒質(zhì)粒（pLVX-shRNA2-BC002811 shRNA）與2種病毒輔助包裝質(zhì)粒（pHelper 1.0和pHelper 2.0）共轉染HEK293T細胞，轉染后8 h將培養(yǎng)基更換為DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，1000轉/min離心5min，收集富含重組慢病毒的上清液，以0.45 μm濾器過濾病毒上清液，再經(jīng)高速離心（4℃，50 000×g）濃縮和0.22 μm濾器過濾，得到高滴度的重組慢病毒濃縮液。采用逐孔倍比稀釋計數(shù)法測定各組的病毒滴度［4］。

1.2.6 慢病毒感染靶細胞按2×104個細胞/孔，將SGC-7901接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)過夜。棄舊培養(yǎng)基，按100 μL/孔加入完全培養(yǎng)基稀釋的重組慢病毒，再加入聚凝胺（終濃度為6 μg/mL），混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染后8 h，將培養(yǎng)基更換為不含聚凝胺的完全培養(yǎng)基。感染后72 h，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。在96孔板培養(yǎng)1～2周后，可將細胞轉至6 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)擴大培養(yǎng)，然后篩選穩(wěn)定細胞克隆。

1.2.7 穩(wěn)定細胞克隆的篩選取重組慢病毒感染的SGC-7901細胞，以胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細胞濃度為50～60個細胞/mL，然后將細胞懸液按100 μL/孔接種于 96孔板。采用有限稀釋法［5］挑選出單個細胞且能表達GFP的孔，將單克隆細胞移入24孔板連續(xù)培養(yǎng)，進行細胞擴增，最后在細胞培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)。

1.2.8 MTS法檢測細胞增殖能力將各組SGC-7901細胞按1×104個細胞/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2分別培養(yǎng) 1、2、3、4、5 d 后每孔加入 10 μL MTS，孵育4 h，之后置于酶標儀在490 nm波長處測定吸光度（A490）值。

1.3 統(tǒng)計學分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)和標準差（±s）描述，組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BC002811 siRNA的篩選qPCR結果顯示，siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組對SGC-7901細胞內(nèi)BC002811的RNA干擾效率分別為87%、81%、66%；與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；其中以 siRNA-1組的干擾效率最高。因此，后續(xù)實驗選擇siRNA-1設計BC002811shRNA。

2.2 BC002811 shRNA重組載體的鑒定插入序列與BC002811 shRNA目標序列完全一致，沒有堿基插入、缺失、突變等異常，見圖1。提示BC002811 shRNA慢病毒載體構建成功。

圖1 BC002811 shRNA慢病毒載體的測序結果Figure 1 Identification images of the lentiviral vector carrying BC002811 shRNA

2.3 慢病毒包裝及病毒滴度測定熒光顯微鏡下可見較強的綠色熒光，見圖2。對照組、shRNA組的病毒滴度分別為4.5×108、3.7×108TU/mL，提示病毒已包裝成功。

圖2 顯微鏡下BC002811 shRNA慢病毒包裝Figure 2 Fluorescence of HEK293T cells packaging BC002811 shRNA lentiviral vectors

2.4 建立穩(wěn)定靶向干擾BC002811表達的SGC-7901胃癌細胞株shRNA組與對照組SGC-7901細胞在形態(tài)學上沒有明顯的差異，其生長狀況良好，穩(wěn)定表達綠色熒光，見圖3。qPCR結果表明，shRNA組BC002811表達水平［（10%±1%）］較對照組明顯降低［（100%±4%）］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示穩(wěn)定靶向干擾BC002811表達的SGC-7901胃癌細胞株構建成功。

2.5 穩(wěn)定靶向干擾BC002811表達對SGC-7901細胞增殖能力的影響與對照組比較，shRNA組的SGC-7901細胞生長速度明顯減慢，提示下調(diào)BC002811表達可抑制SGC-7901細胞增殖。見圖4。

圖3 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定靶向干擾BC002811表達的SGC-7901胃癌細胞株Figure 3 Fluorescence and bright-field images of the gastric cancer SGC-7901 cell line with stable lncRNA BC002811 silencing by lentivirus-mediated RNA interference

圖4 MTS法檢測穩(wěn)定干擾BC002811表達的SGC-7901細胞生長曲線Figure 4 Proliforation of SGC-7901 cells with stable lncRNA BC002811 silencing detected by MTS viability assay

3 討 論

BC002811是一種基因定位于17號染色體長臂2區(qū)5帶中的第1亞帶、長約1686個核苷酸的lncRNA分子。我們以前的lncRNA芯片結果表明，BC002811在胃癌組織中呈異常高表達［3］。近期研究發(fā)現(xiàn)，BC002811表達水平與胃癌的微血管密度及淋巴結轉移呈正相關［6］。但BC002811在胃癌中的生物學功能及其作用機制目前尚未見報道。

siRNA是一類片段長度為21～23個核苷酸的雙鏈小分子RNA；通過以堿基互補配對方式結合靶基因的mRNA并使之降解，siRNA可在轉錄水平抑制靶基因表達［7］。由于具有特異性的基因調(diào)控能力，siRNA已經(jīng)成為基因功能研究常用的一種分子工具。但siRNA在細胞內(nèi)不能進行自主復制，在細胞分化過程中易被降解和稀釋，其瞬時轉染所導致的沉默效應持續(xù)時間短，無法實現(xiàn)對靶基因表達的穩(wěn)定干擾［7-9］。shRNA是一類具有類似雙鏈結構的短發(fā)夾狀RNA分子。它是siRNA的前體，在細胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶剪切加工后可形成siRNA，通過siRNA介導的特異性基因沉默效應發(fā)揮其RNA干擾作用［9］。與siRNA相比，shRNA可通過載體將其基因序列導入細胞，在細胞內(nèi)實現(xiàn)自主復制和轉錄；因此，shRNA在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性更高，作用維持時間更長［7，10］。鑒于此，本研究設計、合成了 3 個針對BC002811的siRNA序列。通過將這些siRNA序列轉染胃癌SGC-7901細胞并進行qPCR檢測，本研究篩選出最有效的BC002811干擾片段siRNA-1。以此作為基礎，本研究在siRNA-1正義鏈和反義鏈基因序列之間引入一段由7個脫氧核苷酸所組成的Loop環(huán)序列，兩端再分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，設計、合成了針對BC002811的shRNA基因序列。

慢病毒是一類來源于人類免疫缺陷Ⅰ型（HIV-Ⅰ）病毒的載體。慢病毒感染宿主細胞后，可將其所攜帶的目的基因高效整合到宿主染色體中，在宿主細胞內(nèi)實現(xiàn)外源性目的基因的持續(xù)穩(wěn)定表達［11-12］。與腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒等其它的病毒載體相比，慢病毒具有免疫原性和細胞毒性低，感染效率高（分裂期細胞和非分裂期細胞均可感染），可容納較大目的基因片段等優(yōu)點，是攜帶干擾RNA的理想載體［11-13］。因此，本研究采用慢病毒作為載體來攜帶BC002811 shRNA，以實現(xiàn)在SGC-7901細胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地下調(diào)BC002811表達。

綜上所述，本研究通過有限稀釋法篩選和qPCR驗證，我們建立了穩(wěn)定靶向干擾BC002811表達的SGC-7901胃癌細胞株，為后續(xù)進一步探討B(tài)C002811在胃癌中的功能及其作用機制奠定了基礎。