夏穗瑞，范曉麗，李清華，吳 偉，陳曉榮，孫 莉

0 引 言

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，多年來的研究表明線粒體功能障礙是PD重要的發(fā)病機制之一［1-3］。與常染色體隱性遺傳家族性PD相關(guān)的基因如PINK1和Pɑrkin直接參與線粒體功能形態(tài)調(diào)節(jié)和維持［4-6］。PTEN誘導激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）定位于線粒體，對線粒體自噬、形態(tài)及質(zhì)量控制均有調(diào)節(jié)作用［7］。大多數(shù)哺乳動物基因組含有19個Wnt基因［8］，屬于12個保守的Wnt亞科，而果蠅中含有7個Wnt基因。果蠅中的wnt2（也稱DWnt2）同源于人類基因Wnt7［9］。Wingless/Int（Wnt）是胚胎發(fā)育期間神經(jīng)發(fā)育和維持成年期神經(jīng)元體內(nèi)平衡的關(guān)鍵途徑。特別是，Wnt經(jīng)典信號途徑與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病相關(guān)［10］，而Wnt2參與Wnt/beta-catenin經(jīng)典信號途徑。Wnt2在PINK1基因干預(yù)背景下的PD中的作用文獻報道較少。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)PINK1B9轉(zhuǎn)基因果蠅中Wnt2 mRNA的表達水平是降低的。那么提高Wnt2的表達對PINK1B9轉(zhuǎn)基因果蠅是否具有影響？本文旨在研究Wnt2過表達對PINK1B9轉(zhuǎn)基因果蠅的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料果蠅品系：MHC-GAL4、UAS-Wnt2OE、UAS-Wnt2RNAi購自美國Bloomington果蠅中心。UAS-PINK1B9/FM7；MHC-Gal4和W1118（野生型）果蠅品系為中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室贈予。

1.2 果蠅構(gòu)建構(gòu)建MHC-GAL4/UAS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因果蠅。將MHC-GAL4處女蠅；W1118雄蠅雜交，收取F1代，基因為W1118/+；MHC-GAL4/+的目的果蠅作為正常對照組。將UAS-PINK1B9/FM7；MHC-GAL4的處女蠅與W1118雄蠅雜交，收取F1代，基因型為UAS-PINK1B9/y；MHC-GAL4/+作為模型組。將UAS-PINK1B9/FM7；MHC-GAL4的處女蠅與UAS-Wnt2 OE果蠅的雄蠅雜交，收取F1代，基因型為UAS-PINK1B9/y；MHC-GAL4/Wnt2 OE作為Wnt2 OE（overexpression，OE過表達）干預(yù)組。將 UAS-PINK1B9/FM7；MHC-GAL4的處女蠅與Wnt2 RNAi果蠅的雄蠅雜交，收取F1代，基因型為UAS-PINK1B9/y；MHC-GAL4/Wnt2 RNAi作為 Wnt2 RNAi干預(yù)組。UAS-Wnt2OE、UAS-Wnt2RNAi果蠅的驗證：采用MHC-GAL4直接啟動相應(yīng)轉(zhuǎn)基因果蠅。提取RNA，運用實時熒光定量PCR檢測各組的Wnt2mRNA表達水平。結(jié)果表明UAS-Wnt2OE果蠅為Wnt2過表達果蠅、UAS-Wnt2RNAi為Wnt2RNAi果蠅。

1.3 果蠅形態(tài)學觀察采用飛行試驗觀察上述4組MHC-GAL4/UAS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因果蠅，每組隨機挑選第5天的目的雄蠅100只，經(jīng)CO2麻醉后，每5只雄蠅裝入1個透明的玻璃飛行管中，0.5～1 h后，待果蠅完全蘇醒，觀察果蠅翅膀形態(tài)，記錄每組翅膀異常數(shù)目，計算其異翅率。觀察果蠅飛行能力，輕敲裝有果蠅的玻璃管壁，計數(shù)飛行的果蠅數(shù)目，計算其飛行率，在相同的條件下，依照上述方法，對第5天的上述4組雄性果蠅重復進行至少3次飛行試驗。

1.4 果蠅肌肉HE染色選取第5天的目的果蠅，顯微鏡下切取完整胸部，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm切片，常規(guī)脫蠟，按說明書行HE染色，光鏡下觀察各組果蠅肌肉病理變化。

1.5 果蠅線粒體觀察每組隨機挑選第5天的目的雄蠅5只，放入2.5%戊二醛（天津市科密歐化學試劑有限公司）中固定，在顯微鏡H-7650，放大倍率30000，直接觀察果蠅胸部間接飛行肌肉中的線粒體形態(tài)。

1.6 果蠅mRNA水平檢測每組切取第5天的目的雄蠅胸部30只，提取各組的總mRNA，使用TaKa-Ra試劑盒對提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到各組果蠅的cDNA，再以cDNA為模板，使用7500Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）儀器進行PCR反應(yīng)，檢測過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（peroxisomeproliferative activated receptorγ activation of auxiliary factor1Alpha，PGC-1α）、核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，Nrf1）、核 DNA編碼的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）表達水平。目的基因具體引物序列如下：18S上游：5′-TCTAGCAATATGAGATTGAGCAATAAG-3′，下游：5′-AATACACGTTGATACTTTCATTGTAGC-3′；Nrf1上游：5′-CGGACGACGATGAGCAACAAGAG-3′，下游：5′-TCGACGACGCGGCTACTGTAC-3′；PGC-1ɑ上游：5′-AAGACGTGCCTTCTGTCGTTCATC-3′，下游：5′-ATTCGGTGCTGGTGCTTCCTTG-3′；TFAM上游：5′-GCTGTCTAAGAACTGGTCCG ATGC-3′，下游：5′-GCGTCAACGAGGTCCTGCTTG-3′；Wnt2上游：5′-CACAACACGCAGCACATTC，下游：TCCCGCTACCCGTCTATTTA-3′。引物由上海生工公司設(shè)計合成。

1.7 Western blot檢測相關(guān)目的蛋白的表達隨機挑選第5天雄性目的果蠅，每組30只，在預(yù)冷的PBS緩沖液中切取果蠅胸部（冰上操作），放入1.5 mL空EP管中，按一定比例加入RIPA組織裂解液及蛋白磷酸酶酶抑制劑（索萊寶公司產(chǎn)品），提取總蛋白。經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠（10%分離膠+5%濃縮膠）電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜，一抗NDUFS3、內(nèi)參Tubulin（Abcam公司產(chǎn)品）孵育4℃過夜，回收抗體，TBST洗滌后，相應(yīng)二抗（中杉金橋公司產(chǎn)品）室溫孵育1 h，TBST洗膜后滴加化學發(fā)光試劑（ThermoFisher公司）發(fā)光液，通過Image Lab 5.1顯影。PVDF膜掃描后用ImageJ圖像軟件進行蛋白條帶分析。

1.8 Oxygraph-2k檢測線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ功能每組切取10只第5天的雄性目的果蠅胸部，加入200 μL呼吸液研磨后再加入200 μL呼吸液離心取上清，按Oxygraph-2k（O2K）高分辨率線粒體呼吸測定系統(tǒng)（Oroboros公司產(chǎn)品）說明書進行操作依次加入呼吸液，樣品上清，底物和抑制劑：丙氨酸、蘋果酸、谷氨酸、ADP、Mg2+、琥珀酸、細胞色素C、FCCP解偶聯(lián)劑、魚藤酮、抗霉素A。所用試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間的均數(shù)比較采用Bonferroni檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Wnt2過表達對模型組表型的影響與正常對照組比較，模型組表現(xiàn)出異翅率升高、飛行率降低（P＜0.05）；與模型組比較，Wnt2OE干預(yù)組異翅率降低、飛行率升高（P＜0.05），Wnt2RNAi干預(yù)組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組異翅率、飛行率數(shù)據(jù)分析(±s,%)Table 1 The data of flight assay in each flies(±s,%)

表1 各組異翅率、飛行率數(shù)據(jù)分析(±s,%)Table 1 The data of flight assay in each flies(±s,%)

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別正常對照組模型組Wnt2OE干預(yù)組Wnt2 RANi干預(yù)組飛行率97.51±0.52 3.95±0.53*41.83±2.57#4.62±0.54 n 20 20 20 20異翅率1.87±0.06 68.79±0.70*10.14±1.72#64.00±3.07#

2.2 Wnt2過表達挽救了模型組線粒體形態(tài)和肌肉形態(tài)HE染色可見正常對照組果蠅肌纖維排列有序，厚薄均勻。模型組肌纖維排列亂，纖維變薄。而Wnt2OE干預(yù)組與模型組對比肌纖維形態(tài)改善。Wnt2RANi干預(yù)組肌肉纖維較薄，排列較亂。透射電鏡下，正常對照組線粒體致密、大小正常，分布均勻。而模型組線粒體膨脹、結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體正常結(jié)構(gòu)消失。Wnt2OE干預(yù)組對比模型組，線粒體膨脹度減弱、可見線粒體大體結(jié)構(gòu)。而Wnt2RNAi干預(yù)組與模型組對比無太大差異。結(jié)果提示W(wǎng)nt2OE可改善模型組果蠅線粒體形態(tài)的紊亂、保護肌纖維。見圖1。

圖1 各組果蠅胸部肌肉HE染色與線粒體電鏡Figure 1 Muscle HE staining and mitochondrial electron microscopy

2.3 Wnt2過表達提高模型組線粒體代謝合成實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組中Nrf1、PGC-1ɑ（過氧化物酶體增殖活化受體輔助活化因子1）基因表達水平降低（P＜0.05），而TFAM（線粒體轉(zhuǎn)錄因子A）變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，Wnt2OE干預(yù)組相關(guān)基因表達水平上升（P＜0.05），而Wnt2RNAi干預(yù)組基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Western blot檢測NDUFS3蛋白水平表達量：與正常對照組比較，模型組中NDUFS3蛋白的表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Wnt2OE干預(yù)組中 NDUFS3蛋白表達水平增高（P＜0.05），見圖2。

圖2 線粒體代謝合成相關(guān)基因的表達水平和NDUFS3蛋白的檢測Figure2 Expression level of mitochondrial metabolic synthesis related genes.B：Western blotting results revealed that NDUFS3 protein were markedly increased in Wnt2 OE intervention flies

2.4 Wnt2過表達挽救了模型組線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ的功能O2K檢測結(jié)果顯示：與正常對照組相比，模型組的線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，Wnt2OE干預(yù)組線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ表達升高（P＜0.05），Wnt2RNAi干預(yù)組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 線粒體高分辨呼吸功能檢測數(shù)據(jù)分析[±s，pmol/(s·mL)]Table 2 High resolution mitochondrial respiratory function test data[±s，pmol/(s·mL)]

表2 線粒體高分辨呼吸功能檢測數(shù)據(jù)分析[±s，pmol/(s·mL)]Table 2 High resolution mitochondrial respiratory function test data[±s，pmol/(s·mL)]

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別正常對照組模型組Wnt2OE干預(yù)組Wnt2RANi干預(yù)組ComplexⅡ36.88±3.80 14.35±1.68*26.87±6.67#14.34±3.95 n 10 10 10 10 ComplexⅠ41.89±7.51 14.70±1.60*25.32±2.79#16.69±2.59

3 討 論

PD是一種常見且復雜的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。第一次詳細說明PD幾乎在兩個世紀前，但其發(fā)病機制仍未確定。遺傳以及線粒體功能障礙等都可能與其發(fā)病有密切的聯(lián)系［11］。目前已發(fā)現(xiàn)13個基因與家族性PD的發(fā)病相關(guān)，包括PINK1、Parkin、DJ-1等。PINK1突變與常染色體隱性遺傳的早發(fā)性PD有關(guān)。絕大多數(shù)PINK1突變的PD患者發(fā)病早（年齡小于40歲），通常具有典型的PD特征［12］。PINK1位于線粒體膜上，具有神經(jīng)保護作用，使神經(jīng)細胞免受線粒體功能障礙所導致的損傷［7］。果蠅中PINK1突變導致線粒體功能障礙、電子傳遞鏈酶活性的降低［13］、黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的功能性損傷［4］。線粒體損傷，影響ATP的產(chǎn)生，導致腦組織供能障礙，嚴重時會造成神經(jīng)細胞的死亡。

Wnt信號通路可調(diào)節(jié)線粒體能量代謝，但不同組織和細胞中表現(xiàn)不盡相同。經(jīng)典Wnt/betacatenin信號途徑在Wolfram綜合征模型小鼠iPSC中（疾病模型表現(xiàn)為線粒體數(shù)目減少，嵴不成熟，功能障礙）顯著下調(diào)［14］。在成纖維細胞中，經(jīng)典的Wnt/beta-catenin信號途徑增強線粒體生物合成和O2消耗［15］。 抑制Wnt3A降低了脂肪細胞的氧化代謝［16］。此外，當Wnt3A以非經(jīng)典途徑阻斷時，在成骨細胞分化期間檢測到糖酵解活性的增加［17］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Wnt2增強線粒體生物合成相關(guān)基因PGC-1α、Nrf1、TFAM的表達。PGC-1α是一種共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過激活參與調(diào)節(jié)能量代謝的不同轉(zhuǎn)錄因子來誘導線粒體生物合成。PGC-1α的神經(jīng)保護作用已經(jīng)在體內(nèi)和體外的各種神經(jīng)變性疾病中得到證實［18］。TFAM是mtDNA復制、修復和轉(zhuǎn)錄所必需的［19］。Nrf1調(diào)節(jié)由核編碼的線粒體呼吸鏈部分亞基的表達，促進線粒體的合成［20］。過表達Wnt2后上調(diào)了NDUFS3蛋白的表達水平，間接反映線粒體復合物Ⅰ的活性提高，O2K的結(jié)果也顯示W(wǎng)nt2OE改善PINK1B9轉(zhuǎn)基因果蠅線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ功能。由此，我們推測Wnt2OE可通過提高Nrf1、PGC-1α及下游基因TFAM表達使得線粒體生物合成增加，并提高線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ呼吸功能，減輕了PINK1B9轉(zhuǎn)基因果蠅中線粒體功能障礙。

總之，本研究表明Wnt2過表達通過改善飛行肌與線粒體形態(tài)，提高線粒體ComplexⅠ、ComplexⅡ功能對PINK1B9轉(zhuǎn)基因果蠅具有神經(jīng)保護作用。然而本研究存在不足之處，首先模型單一局限于果蠅，需在小鼠等更高等動物模型上進一步驗證。其次實驗機制研究停留在形態(tài)和表達變化上，需進一步深入探討相關(guān)通路及機制。