祁荊荊，張卓亞，伍樹芳，黃賽賽，姚根宏

0 引 言

干燥綜合征（Sj?gren′s syndrome，SS）是一種復(fù)雜的自身免疫病，其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，而且缺乏有效的治療手段［1］。研究表明，先天免疫系統(tǒng)在SS發(fā)病早期發(fā)揮重要作用，而且SS患者中B細(xì)胞高度活化的機(jī)制也越來越明確［2-3］。對(duì)SS病理生理學(xué)和發(fā)病機(jī)制的深入研究，將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療策略。髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）具有一定的免疫抑制功能，可以對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行多方面的調(diào)節(jié)［4］。一些研究提示MDSCs參與了多種自身免疫?。?-7］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，模型小鼠中MDSCs數(shù)量增加和功能改變，但MDSCs在SS中的具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。Th2細(xì)胞反應(yīng)以分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-9、IL-10及IL-13等為主要特征［8］。前期研究表明SS患者中存在Th1/2細(xì)胞失衡現(xiàn)象［9-10］。此外，MDSCs也可通過調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞反應(yīng)參與感染等疾?。?1-12］。本研究中，我們通過向NOD小鼠過繼移植MDSCs或清除其體內(nèi)MDSCs的方法，觀察小鼠SS樣癥狀的變化，從而揭示MDSCs參與SS發(fā)病的具體機(jī)制，有望為臨床治療SS患者提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料雌性NOD小鼠30只，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，體重（21.5±0.8）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（蘇）2014-0052。小鼠于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（35±5）%，每12小時(shí)明暗交替。Rat IgG2b、Ly-6G（Gr-1）（RB6-8C5）、antimouse CD11b-APC（Clone M1/70）、anti-mouse Gr1-PE（CloneRB6-8C5）、anti-mouseCD4-FITC（CloneGK1.5）和anti-mouseIL-4-PE（Clone11B11）（美國eBioscience公司）。佛波酯、離子霉素和brefeldin A（美國Enzo LifeScience公司）。小鼠IL-4的ELISA試劑盒（美國R&D Systems公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液流量檢測(cè)小鼠麻醉后，腹腔注射毛果蕓香堿（0.1 mg/kg體重），然后計(jì)算唾液流量（mL/15 min）。

1.2.2 頜下腺病理留取小鼠頜下腺組織，4%多聚甲醛固定過夜，后石蠟包埋和切片，然后切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察淋巴細(xì)胞浸潤并拍照。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDSCs和Th2細(xì)胞小鼠處死后，留取脾，經(jīng)過研磨、過濾和裂解紅細(xì)胞后，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。Ficoll法分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。檢測(cè)MDSCs：細(xì)胞懸液中加入熒光抗體，anti-mouse CD11b-APC，anti-mouse Gr1-PE［13］，室溫避光孵育15 min，加1 mL PBS洗滌細(xì)胞，離心棄上清，重懸細(xì)胞并于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。取適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞與熒光標(biāo)記抗體共孵育，然后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。檢測(cè)Th2細(xì)胞：先用20 ng/mL 佛波酯、1 μg/mL離子霉素及5 μg/mL brefeldin A于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后，標(biāo)記表面標(biāo)志對(duì)應(yīng)的流式抗體anti-mouse CD4-FITC，并破胞膜后標(biāo)記胞膜內(nèi)標(biāo)志對(duì)應(yīng)的流式抗體anti-mouse IL-4-PE［14］。采用 FlowJo軟件分析結(jié)果。

1.2.4 過繼移植MDSCs根據(jù)MDSCs分離和純化試劑盒（Miltenyi Biotec）說明書，分離和純化4周齡NOD小鼠（未出現(xiàn)SS樣癥狀）脾MDSCs，制成單細(xì)胞懸液。將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為PBS組（注射等量的PBS）和MDSCs組（移植MDSCs 1×106個(gè)/鼠），每組5只。

1.2.5 清除MDSCs將10周齡NOD小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為Rat IgG2b組和anti-Gr1組，每組5只，參照文獻(xiàn)［15］方法，anti-Gr1組小鼠腹腔注射anti-Gr1抗體，250 μg/只，每3天注射1次，共5次。 Rat IgG2b組注射等量Rat IgG2b同型對(duì)照抗體。

1.2.6 ELISA檢測(cè)根據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)SS模型小鼠血漿IL-4水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩組間之間比較采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠MDSCs量變化比較流式結(jié)果顯示，與PBS組相比，MDSCs移植組小鼠外周血及脾MDSCs顯著增加（P＜0.05）。與 Rat IgG2b組相比，anti-Gr1組小鼠外周血及脾MDSCs顯著降低（P＜0.05），見圖1，表1。

2.2 過繼移植MDSCs對(duì)小鼠SS樣癥狀的影響HE染色結(jié)果顯示，與PBS組相比，MDSC移植組頜下腺中淋巴細(xì)胞浸潤灶增加，而且浸潤面積明顯增大，唾液流量顯著降低（P＜0.05）。與Rat IgG2b組相比，anti-Gr1組小鼠頜下腺中淋巴細(xì)胞浸潤灶減少，而且浸潤面積明顯減小，唾液流量顯著增加（P＜0.05），見圖2，表1。

圖1 小鼠外周血和脾中MDSCs流式細(xì)胞圖Figure 1 The representive flow cytometry of MDSCs in blood and spleen

圖2 鏡下觀察小鼠頜下腺中淋巴細(xì)胞浸潤情況（HE×100）Figure 2 Lymphocyte infiltration in submandibular glands of NOD mice under microscope（HE ×100）

表1 NOD小鼠唾液流量及外周血和脾MDSC的變化（±s）Table 1 Myeloid-derivedsuppressorcells(MDSC)intheperipheral blood and spleen and salivary flow of the non-obesediabeticmiceindifferentgroups（±s）

表1 NOD小鼠唾液流量及外周血和脾MDSC的變化（±s）Table 1 Myeloid-derivedsuppressorcells(MDSC)intheperipheral blood and spleen and salivary flow of the non-obesediabeticmiceindifferentgroups（±s）

與PBS組相比，*P＜0.05；與Rat IgG2b組相比，#P＜0.05

組別PBS組MDSC移植組Rat IgG2b組anti-Gr1組唾液流量（μL/15min）78.70±6.80 33.85±11.25*56.48±14.18 121.20±10.34#n 5 5 5 5外周血MDSC（×105）個(gè)1.54±0.14 5.47±1.54*1.53±0.12 0.35±0.16#脾MDSC（×105）個(gè)1.09±0.23 4.50±1.04*2.53±1.10 0.91±0.07#

2.3 MSDCs抑制NOD小鼠Th2細(xì)胞數(shù)量及活性與PBS組相比，MDSC移植組小鼠外周血及脾Th2細(xì)胞數(shù)量及血漿IL-4水平都顯著降低（P＜0.05）。與Rat IgG2b組相比，anti-Gr1組小鼠外周血及脾Th2細(xì)胞數(shù)量則顯著升高（P＜0.05），血漿 IL-4水 平 無 明 顯 變 化（P＞0.05）。 見 圖3，表2。

圖3 小鼠外周血和脾中Th2細(xì)胞流式細(xì)胞圖Figure 3 The representive flow cytometry of Th2 cells in blood and spleen

表2 NOD小鼠外周血和脾Th2細(xì)胞及血漿IL-4變化（±s）Table 2 Expression of Th2 cells in the peripheral blood and spleen and the IL-4 level in the plasma of the non-obese diabetic mice in different groups（xˉ± s）

表2 NOD小鼠外周血和脾Th2細(xì)胞及血漿IL-4變化（±s）Table 2 Expression of Th2 cells in the peripheral blood and spleen and the IL-4 level in the plasma of the non-obese diabetic mice in different groups（xˉ± s）

與PBS組相比，*P＜0.05；與Rat IgG2b組相比，#P＜0.05

組別PBS組MDSCs移植組Rat IgG2b組anti-Gr1組IL-4(pg/mL)18.98±1.50 13.60±0.54*18.08±1.20 16.65±2.84 n 5 5 5 5外周血Th2比例(%)0.67±0.13 0.16±0.07*0.55±0.09 0.92±0.10#脾Th2數(shù)目(×105個(gè))1.20±0.26 0.57±0.29 0.73±0.18 1.39±0.12#比例(%)0.80±0.13 0.37±0.04*0.63±0.08 1.10±0.06#數(shù)目(×105個(gè))1.57±0.22 0.88±0.05*1.43±0.20 2.42±0.03#

3 討 論

盡管研究表明B細(xì)胞的異?；罨荢S發(fā)病的一個(gè)重要特征，而且靶向B細(xì)胞治療SS也已取得較好的效果。但是，SS并非僅僅是B細(xì)胞引起的疾病，其他免疫細(xì)胞也會(huì)參與其發(fā)病［3，16］。因此，有必要進(jìn)一步研究SS的發(fā)病機(jī)制，為其臨床治療發(fā)掘更有效的治療策略。我們研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs通過抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)加重NOD小鼠SS癥狀。一些研究表明，Th2細(xì)胞可通過促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生自身免疫抗體免疫球蛋白E［17］，并促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）及SS發(fā)?。?8-19］。而本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SS模型NOD小鼠外周血中MDSCs顯著增加，IL-4水平顯著降低。這可能由Th1/2細(xì)胞失衡及免疫細(xì)胞反應(yīng)紊亂所致［10］。

流式細(xì)胞術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、客觀檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。不同白細(xì)胞表面帶有不同的分子標(biāo)記。對(duì)于一些特定細(xì)胞，其內(nèi)部會(huì)分泌特異性細(xì)胞因子，我們可以通過檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子來對(duì)該類細(xì)胞進(jìn)行鑒定。輔助性T細(xì)胞，簡稱Th細(xì)胞，能分泌多種細(xì)胞因子。常見Th細(xì)胞為Th1/2/17，相應(yīng)的特異性標(biāo)記為CD4和IFN-γ/IL-4/IL-17。靜止的T、B細(xì)胞不產(chǎn)生或產(chǎn)生細(xì)胞因子極低，多數(shù)細(xì)胞因子必須在T細(xì)胞激活后才能分泌產(chǎn)生?；罨疶細(xì)胞信號(hào)激活劑常用的有佛波酯、離子霉素。免疫細(xì)胞激活后，再用高爾基體阻斷劑阻斷胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，使細(xì)胞因子聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。正常情況下，抗體無法穿過完整的細(xì)胞膜，故細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子無法被標(biāo)記，因此標(biāo)記表面標(biāo)志抗體后要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定并破胞膜，即穩(wěn)定細(xì)胞膜，保持細(xì)胞膜表面抗體與抗原結(jié)合的作用后使完整的細(xì)胞膜產(chǎn)生小孔以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞。目前，檢測(cè)白細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的方法很多，其中流式細(xì)胞術(shù)是使用最廣泛且最有效的檢測(cè)方法［20］。本研究中通過計(jì)數(shù)脾和外周血總白細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞百分比來計(jì)算Th2細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)。

MDSCs是骨髓來源的未成熟髓系細(xì)胞，其主要特征為通過ROS、NO、Arg-1等抑制T功能［5］。初期研究表明，MDSCs與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs參與了自身免疫反應(yīng)及自身免疫性疾病病程。據(jù)報(bào)道，MDSCs在SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等多種自身免疫病中明顯增多。增加MDSCs加重SLE及RA模型鼠癥狀，而刪除 MDSCs則改善相應(yīng)癥狀［13，21-22］。與本研究中MDSCs參與SS發(fā)病的作用一致。前期研究表明，MDSCs可通過促進(jìn)Th1或Th17細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)自身免疫病的發(fā)展，清除MDSCs后則可有效改善自身免疫?。?3，22-27］。NOD小鼠是一種攜帶 MHCII IAg7分子的小鼠品系，其能自發(fā)出現(xiàn)胰腺淋巴細(xì)胞浸潤，進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫性糖尿病即一型糖尿?。?8］。研究發(fā)現(xiàn)，NOD小鼠于第4周開始，胰腺中出現(xiàn)T細(xì)胞浸潤，但14周齡前并未出現(xiàn)胰腺功能損傷。NOD小鼠外分泌腺體中也發(fā)現(xiàn)有淋巴細(xì)胞浸潤，于12周左右外分泌腺體中存在淋巴細(xì)胞浸潤并導(dǎo)致唾液腺功能異常，是公認(rèn)的SS樣小鼠模型之一［29］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)4周齡NOD小鼠并未出現(xiàn)SS樣癥狀，但SS患者及8～12周齡SS樣NOD小鼠外周血都有明顯的MDSCs累積現(xiàn)象，推測(cè)MDSCs參與了SS發(fā)病，并發(fā)揮促炎作用。據(jù)報(bào)道，Th1/2細(xì)胞平衡在SS中也發(fā)揮重要作用，Th1細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子（IFN-γ和IL-12）在SS患者及SS樣NOD小鼠中都有促炎作用［30-32］。而Th2細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4則可改善NOD小鼠包括SS癥狀在內(nèi)的自身免疫疾病癥狀［31，33-34］和其他Th1細(xì)胞引起的自身免疫?。?5-36］。本研究結(jié)果顯示，SS模型小鼠中Th2細(xì)胞及其相關(guān)的IL-4都顯著降低，而Th1細(xì)胞則無明顯變化。據(jù)研究報(bào)道，Th17細(xì)胞其相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-17A）可促進(jìn)SS發(fā)病［37-39］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NOD小鼠外周血中Th17細(xì)胞顯著增加，但NOD脾Th17細(xì)胞則無明顯變化。總之，本研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs可抑制Th2細(xì)胞，而不是Th1或Th17細(xì)胞，加重SS。這可能由于不同的炎性因子內(nèi)環(huán)境造成了MDSCs在各種自身免疫病中表現(xiàn)出不同的作用機(jī)制所致［40］。

綜上，MDSCs和Th2細(xì)胞反應(yīng)在SS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，而且，MDSCs可抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)促進(jìn)SS發(fā)病，清除MDSCs則可促進(jìn)Th2細(xì)胞反應(yīng)抑制SS發(fā)病，靶向MDSCs和Th2細(xì)胞有望成為SS臨床治療的新手段。