周美云，鄭倩雯，欒曉瑾，顏一丹，陳萬銀，王 敏，謝 冰，喬 晨，方 杰，于 駿，陳 霞

0 引 言

干細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡對細(xì)胞和組織發(fā)育至關(guān)重要，它們可以通過自我更新和分化過程調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)［1-2］。果蠅睪丸中存在兩種不同類型的干細(xì)胞，包括生殖干細(xì)胞（germline stem cells，GSCs）和體細(xì)胞干細(xì)胞（somatic stem cells，SSCs），對維持GSCs的細(xì)胞命運(yùn)和分化過程都具有極為重要的作用［3］。GSCs微環(huán)境可以維持GSCs和SSCs的存活。有研究表明，GSCs可以通過不對稱分裂的方式分化為精原細(xì)胞，并經(jīng)過精母細(xì)胞、圓形精子、長形精子的分化過程，最終形成精子細(xì)胞［4］。而SSCs可以分化為成熟的包囊細(xì)胞，對生殖細(xì)胞的增殖、生長和分化提供微環(huán)境［3］。

果蠅睪丸GSCs的自我更新和分化過程受到細(xì)胞內(nèi)源信號和細(xì)胞外信號的嚴(yán)格調(diào)控［4-5］。目前已經(jīng)證實(shí)了一些經(jīng)典的信號通路（如JAK-STAT、Hedgehog等）可以調(diào)控果蠅睪丸GSCs的自我更新和分化過程，但其調(diào)控機(jī)制仍非常不清楚，因此亟需進(jìn)一步探索其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來闡明人非梗阻性無精子癥和睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的致病機(jī)制。在我們前期的研究中［6］，通過果蠅UAS-Gal4系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模果蠅睪丸RNA干擾（RNA interference，RNAi）篩選，共發(fā)現(xiàn)了221個(gè)GSCs調(diào)控因子，而這些GSCs調(diào)控因子在果蠅睪丸GSCs微環(huán)境中發(fā)揮了多樣的作用。在這些鑒定到的調(diào)控因子中，不乏已經(jīng)被證實(shí)參與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因（如bɑm、tut等）［7-9］。

泛素是一種很小的蛋白質(zhì)（包含76個(gè)氨基酸），并在所有的真核生物中高度保守。泛素可以通過與其他蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，以多種方式修飾蛋白質(zhì)活性。泛素以融合蛋白的方式進(jìn)行表達(dá)，通常表現(xiàn)為多泛素，或者與核糖體蛋白L40和S27a相結(jié)合［10-11］。通過分析，我們推測Ubi-p63E基因可能是一個(gè)重要的GSCs微環(huán)境調(diào)控因子。Ubi-p63E基因編碼的蛋白是一個(gè)多泛素化前體蛋白，該蛋白被去泛素酶處理后可以分解為多個(gè)泛素化分子。它們主要與對應(yīng)的靶蛋白相關(guān)結(jié)合，參與調(diào)控了蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞自噬、細(xì)胞程序性死亡、等多種生物學(xué)過程［12］。本研究主要以Ubi-p63E基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，綜合運(yùn)用遺傳學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等技術(shù)手段，對Ubi-p63E基因的生物學(xué)功能進(jìn)行深入的分析，探討其在睪丸GSCs微環(huán)境中調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果蠅品系UAS-Ubi-p63E RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅從清華果蠅中心（Tsinghua Fly Center，THFC）購得，該品系來源于TRiP RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫（Transgenic RNAi Project）。Gɑl4轉(zhuǎn)基因果蠅品系信息如下：nos-Gɑl4（BDSC，#4937），tj-Gɑl4（DGRC，#104055）。W1118品系果蠅為野生型果蠅，作為對照組果蠅使用，來源于THFC果蠅庫。所有果蠅均在穩(wěn)定的環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)：保種果蠅和實(shí)驗(yàn)用果蠅均在溫度25℃、相對濕度60%的條件下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器（生工生物工程股份有限公司，中國），免疫熒光一抗Vasa（Santa Cruz Biotechnology，美國），免疫熒光一抗 Eya（Developmental Studies Hybridoma Bank，美國），免疫熒光一抗DE-cad（Developmental Studies Hybridoma Bank，美國），免疫熒光一抗FasIII（Developmental Studies Hybridoma Bank，美國），免疫熒光一抗1B1（Developmental Studies Hybridoma Bank，美國），免疫熒光一抗PH3（Cell Signaling Technology，美國），免疫熒光488-兔二抗、cy3-小鼠二抗、647-大鼠二抗（Molecular Probes and Jackson Immunologicals公司，美國），Hoechst 33342（Invitrogen，美國），激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss Lsm710，德國），4℃離心機(jī)（Eppendorf，德國），28℃恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國），精細(xì)鑷子（Roboz，美國）。

1.2 方法

1.2.1 果蠅雜交策略挑選GAL4品系（nos-GAL4或者tj-GAL4）雄性果蠅與UAS-Ubi-p63E RNAi品系的處女果蠅雜交。在F1代中挑選特定基因型（nos＞Ubi-p63E RNAi和tj＞Ubi-p63E RNAi）的果蠅用于功能學(xué)分析。在本研究中，W1118品系果蠅為對照組，nos＞Ubi-p63E RNAi組（早期生殖細(xì)胞中敲減Ubip63E基因）和tj＞Ubi-p63E RNAi組（包囊細(xì)胞中敲減Ubi-p63E基因）果蠅為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 生育率測試在F1代果蠅中挑選單只特定基因型（Gal4＞UAS-Ubi-p63E RNAi）的成年雄蠅與3只野生型（W1118）處女蠅雜交，觀察其是否可以獲得后代果蠅。本實(shí)驗(yàn)共選取對照組果蠅73只，nos＞Ubip63E RNAi組果蠅113只，以及tj＞Ubi-p63E RNAi組果蠅97只。通過統(tǒng)計(jì)F1代單只雄性果蠅生育比例來判斷雄性果蠅生育能力。

1.2.3 免疫熒光染色本實(shí)驗(yàn)共選取對照組果蠅23只，nos＞Ubi-p63E RNAi組果蠅 31 只，以及 tj＞Ubip63E RNAi組果蠅17只。取特定基因型的果蠅睪丸，用4%多聚甲醛固定20 min后，用含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）的PBS清洗睪丸3次，10 min/次，5%的牛血清白蛋白封閉30 min，加入一抗于4℃冰箱孵育過夜后再用含0.1%TritonX-100的PBS清洗3遍，除去未結(jié)合的一抗，再用相應(yīng)的二抗在室溫孵育1h，最后用含0.1%TritonX-100的PBS清洗，去除多余的二抗，將睪丸置于普通載玻片上，用30 μL 1.0 mg/mL的Hoechst33342染DNA 5 min，加入20 μL80%甘油，蓋上蓋玻片封片。果蠅睪丸免疫熒光圖片通過共聚焦激光顯微鏡采集，圖片處理采用Adobe Photoshop CS5。

在果蠅睪丸中，Vasa抗體可以標(biāo)記生殖細(xì)胞，眼缺陷蛋白（eyes absent，Eya）可以標(biāo)記成熟的包囊細(xì)胞，黏附蛋白DE-cad是中心細(xì)胞核和包囊細(xì)胞的標(biāo)記物，1B1抗體可以標(biāo)記生殖細(xì)胞間的融合體，F(xiàn)asIII抗體可以標(biāo)記中心細(xì)胞，而PH3作為細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，在正常果蠅睪丸的早期生殖細(xì)胞中僅有少量表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定性資料表達(dá)采用百分比（%），組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ubi-p63E基因的生育率測試生育率測試結(jié)果表明，與對照組生育率（97.26%）相比，nos＞Ubip63E RNAi組（0%）和tj＞Ubi-p63E RNAi組生育能力（4.12%）明顯降低（P＜0.01）。

2.2 在早期生殖細(xì)胞中敲減Ubi-p63E基因影響生殖細(xì)胞的細(xì)胞維持功能與對照組相比，nos＞Ubip63E RNAi組和 tj＞Ubi-p63E RNAi組睪丸形態(tài)明顯異常，長度分別為對照組的22.77%、18.86%，均出現(xiàn)小睪丸的表型，見圖1。

圖1 鏡下觀察果蠅睪丸形態(tài)（×40）Figure 1 Morphology of the Drosophila testes under the light microscope（×40）

與對照組睪丸相比，nos＞Ubi-p63E RNAi睪丸長度明顯變短，睪丸中的GSCs完全消失（與中心細(xì)胞相鄰的細(xì)胞為Vasa陰性細(xì)胞），剩余的生殖細(xì)胞也幾乎完全消失，睪丸出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性塌陷，進(jìn)而出現(xiàn)包囊細(xì)胞的代償性增生（Eya陽性細(xì)胞明顯積累）。見圖2。

2.3 在包囊細(xì)胞中敲減Ubi-p63E基因影響生殖細(xì)胞的分化功能免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組睪丸比較，tj＞Ubi-p63E RNAi組正常睪丸形態(tài)消失，且出現(xiàn)較多異常的細(xì)胞團(tuán)塊。這些細(xì)胞團(tuán)大多為Vasa陽性細(xì)胞，而1B1標(biāo)記的融合體完全呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布，見圖3。

與對照組睪丸相比，tj＞Ubi-p63E RNAi組睪丸中的未分化生殖細(xì)胞團(tuán)塊失去了中心細(xì)胞的調(diào)控，均出現(xiàn)PH3陽性的增殖細(xì)胞，見圖4。

圖2 在早期生殖細(xì)胞中敲減Ubi-p63E基因的睪丸表型分析（免疫熒光染色×400）Figure 2 Phenotypes of the Drosophila testes with knockdown of the Ubi-p63E gene in the early germ cells（IF ×400）

圖3 在包囊細(xì)胞中敲減Ubi-p63E基因的睪丸表型分析（免疫熒光染色×400）Figure 3 Phenotypes of the Drosophila testes with knockdown of the Ubi-p63E gene in the cystoblasts（IF ×400）

圖4 未分化的生殖細(xì)胞團(tuán)塊的增殖能力分析（免疫熒光染色×400）Figure 4 Proliferation of the undifferentiated germ cell masses in the Drosophila testes（IF ×400）

3 討 論

睪丸GSCs微環(huán)境對于維持正常的GSCs自我更新過程具有非常重要的調(diào)控作用，而其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不十分清楚。本文報(bào)道了Ubi-p63E基因在果蠅睪丸中調(diào)控GSCs微環(huán)境的作用。本研究在GSCs微環(huán)境中使用了兩種不同的Gals（即nos-Gal4和tj-Gal4）來驅(qū)動(dòng)Ubi-p63E RNAi的表達(dá)。Nos-Gal4主要在GSCs和精原細(xì)胞中表達(dá)，而tj-GAL4主要在包囊細(xì)胞中表達(dá)［6，13］。本研究結(jié)果提示，Ubi-p63E基因在果蠅睪丸GSCs微環(huán)境中發(fā)揮了關(guān)鍵作用：Ubi-p63E基因在早期生殖細(xì)胞中通過自主性調(diào)控方式影響其自我更新過程，并可以利用早期包囊細(xì)胞以非自主性的調(diào)控方式促進(jìn)GSCs分化過程。

由于下調(diào)Ubi-p63E基因的表達(dá)水平可以影響果蠅生殖細(xì)胞的命運(yùn)（絕大部分生殖細(xì)胞明顯消失，睪丸結(jié)構(gòu)出現(xiàn)塌陷），因此無法對這些睪丸進(jìn)行干涉效率驗(yàn)證。本研究所用的UAS-Ubi-p63E RNAi品系果蠅來源于TRiP RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫。目前很多重要的果蠅RNAi實(shí)驗(yàn)都是通過該果蠅庫進(jìn)行大規(guī)模果蠅RNAi篩選，這些研究結(jié)果均提示TRiP RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫的脫靶效率是非常低的［6，14-16］。

通過Flybase數(shù)據(jù)庫（http：//flybase.org/）分析發(fā)現(xiàn)，Ubi-p63E是果蠅睪丸優(yōu)勢表達(dá)蛋白。Ubi-p63E基因編碼了一種泛素化蛋白，它可以影響泛素化的穩(wěn)態(tài)平衡。從酵母到哺乳動(dòng)物，有兩種結(jié)構(gòu)的泛素化蛋白是高度保守的（即多泛素化蛋白和單泛素化蛋白），而Ubi-p63E蛋白是果蠅一種多泛素化蛋白。在雄性果蠅中缺失Ubi-p63E基因是可以存活的，其缺陷表型與臨床上的人無精子癥極為相似［17-18］。Ubi-p63E蛋白可以通過調(diào)控精子細(xì)胞的分化過程而導(dǎo)致雄性不育［19］。有趣的是，缺失Ubi-p63E基因不影響雌性生育能力，提示它可能是睪丸特異性調(diào)控的泛素化蛋白。雖然該研究提示Ubi-p63E基因影響果蠅了精母細(xì)胞的分化過程，但是Ubi-p63E基因在果蠅睪丸GSCs微環(huán)境中的調(diào)控作用尚不清楚。有證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)紊亂的泛素化過程可能調(diào)控了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［20］。本研究對Ubi-p63E基因在GSCs分化障礙和生殖系腫瘤形成等方面的功能注釋進(jìn)行了重要的補(bǔ)充。

目前認(rèn)為，睪丸生殖細(xì)胞腫瘤主要是由于生殖細(xì)胞分化和成熟障礙所造成的［18］，其致病遺傳因素目前仍不清楚。有證據(jù)顯示，精原細(xì)胞瘤患者在年輕時(shí)也存在生育相關(guān)問題，這就提示了不育癥可能是生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一［21-22］。果蠅和人睪丸生精過程有很多相似之處。很多人和果蠅的基因突變都有相似的果蠅睪丸表型［2］。與人類相似，果蠅同樣可以因?yàn)樯臣?xì)胞分化障礙和過度增殖而發(fā)展成睪丸腫瘤［23］。有研究報(bào)道顯示，異常的SSCs在果蠅睪丸中可以影響GSCs的分化障礙，并最終介導(dǎo)了生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生［6，24］。

綜上，Ubi-p63E基因作為一個(gè)睪丸優(yōu)勢表達(dá)的GSCs調(diào)控因子，在GSCs微環(huán)境中發(fā)揮了重要的作用，主要調(diào)控了GSCs的自我更新和分化過程。我們的研究揭示了Ubi-p63E基因在果蠅睪丸中的生物學(xué)功能，闡明了睪丸GSCs微環(huán)境如何影響精子發(fā)生過程和調(diào)控睪丸生殖細(xì)胞腫瘤形成，為深入理解人非梗阻性無精子癥和睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為臨床早期精準(zhǔn)診斷和早期防治提供新思路。