王宇翔，徐海棟

0 引 言

頸椎病、腰椎間盤突出及腰椎管狹窄等脊柱功能退變性疾病作為常見且多發(fā)的疾病，造成了嚴重的社會和經(jīng)濟負擔［1-3］。椎間盤功能退變通常表現(xiàn)為椎間盤髓核水分的丟失、纖維環(huán)的破裂及髓核的突出、椎間盤高度的丟失，往往會導致椎間盤源性腰痛，并出現(xiàn)椎間盤突出和繼發(fā)性椎管狹窄相關(guān)的神經(jīng)壓迫癥狀［4］。

目前研究認為，炎癥因子的過量表達導致的椎間盤細胞外基質(zhì)的減少以及髓核細胞的凋亡是造成椎間盤功能退變的主要原因［5］。眾多炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2、PGE等較正常的椎間盤表達升高。其中TNF-α是目前研究最多、強有力的炎性細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和其相應的受體在正常的椎間盤和功能退變的椎間盤中都有表達，并且上調(diào)降解酶［基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和 ADAMTS］mRNA 的表達導致細胞外基質(zhì)的降解，使得細胞基質(zhì)合成減少［6］。其中MMPs家族在椎間盤功能退變過程中高表達，在細胞外基質(zhì)降解中起著最直接的作用。

艾拉莫得是一種新型的治療類風濕疾病的藥物［7-8］。大量研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)，艾拉莫得能夠抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17以及NF-κB等炎癥因子在類風濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細胞和人單核細胞中的表達［9-10］。目前艾拉莫德多用于風濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究，也有關(guān)于其抑制肝細胞癌變、預防免疫性腎炎的報道［11-12］，但對于椎間盤功能退變的作用尚無相關(guān)研究。本研究旨在評估艾拉莫德對功能退變椎間盤的髓核細胞炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗方法

1.1.1 大鼠椎間盤髓核細胞的分離和培養(yǎng)選用8～12周齡SD大鼠共60只，體重在650～800 g，雌雄不限，動物實驗許可證號：SYXK（軍）2012-0047。隨機分為加壓組和對照組，每組30只。加壓組用外固定加壓裝置加壓大鼠尾部6～8周；將腹腔注射水合氯醛處死的大鼠放入75%乙醇浸泡消毒10 min，嚴格無菌操作下，用刀片切開大鼠尾巴切開纖維環(huán)，在放大鏡下，使用尖刀片取出凝膠樣的髓核組織；剪碎組織后加入0.25%胰蛋白酶，持續(xù)震蕩下，于37℃水浴中消化15 min。離心、沖洗后加入0.025%II型膠原酶，于37℃水浴中消化4 h，至僅剩余少量組織碎屑；去除未消化的組織碎屑，細胞懸液1000 r/min，離心5 min，棄上清；髓核細胞重懸后接種于6 cm培養(yǎng)皿，于5%CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中；每3天換液一次，當原代髓核細胞生長至80%～90%融合時，按照1∶3比例傳代擴增，至第2代。分離培養(yǎng)大鼠退變椎間盤的髓核細胞。對照組大鼠不加壓處理。本研究所用于實驗的髓核細胞均為第2代。

1.1.2 髓核細胞表型鑒定待第1代髓核細胞生長至80%～90%融合時，消化傳代接種至鋪有細胞爬片的6孔細胞培養(yǎng)板中，于5%CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下確認細胞爬片上的第2代髓核細胞生長至80%～90%融合時，棄去培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛室溫下固定細胞6 h。分別用0.1%Triton X-100、3%過氧化氫室溫下處理細胞后，加入2%BSA，37℃封閉1 h。加入抗大鼠II型膠原和Aggrecan的一抗4℃孵育過夜。然后加入熒光二抗（1∶100）室溫下孵育1 h。在共聚焦顯微鏡（日本Olympus）下觀察熒光圖像（波長=594 nm），并拍照記錄。

1.1.3 艾拉莫德細胞毒性檢測在髓核細胞中分別加入不同濃度的艾拉莫德（0、0.3、30、50、100、150 μg/mL），于5%CO2，37 ℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入CCK-8試劑10 μL，于5%CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。以空白培養(yǎng)基為空白對照，使用酶標儀檢測在450 nm波長處的吸光度。并按公式計算細胞活力。

1.1.4 髓核細胞炎癥因子和MMP的分泌測定根據(jù)ELISA試劑盒說明書梯度稀釋IL-6標準品，分別加入酶標包被板中，再依次加入IL-6抗體10 μL、鏈霉素親和素-辣根過氧化酶50 μL，37℃孵育1 h。沖洗酶標包被板5次后依次加入顯色液A和顯色液B各10 μL，避光常溫孵10 min。使用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度；以只加顯色液和終止的孔為空白對照，建立標準曲線（3個復孔）。收取各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，4000 r/min離心10 min取上清，按照以上步驟使檢測樣品培養(yǎng)基在450 nm波長處的吸光度，根據(jù)標準曲線，檢測IL-6在培養(yǎng)基中的含量。同法使用ELISA試劑盒測定TNF-α、MMP-3、MMP-9、IL-8、NF-KB在養(yǎng)基中的含量。

1.1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）檢測炎癥相關(guān)基因表達將髓核細胞置于5%CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長至80%～90%融合時，更換培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的艾拉莫得（0、0.3、3、10、20、30 μg/mL），于5%CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。提取細胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制Real-time PCR反應體系，輕柔震蕩混勻體系。配制的Real-time PCR反應體系于實時熒光定量PCR儀（ABI-7500）反應檢測相應Ct值，使用β-actin作為內(nèi)參，使用標準的2-ΔΔCt計算各目標基因相對表達量。

1.2 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均值比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 加壓功能退變模型椎間盤病理表現(xiàn)對照組大鼠椎間盤可見髓核及纖維環(huán)形態(tài)學基本正常；而加壓組大鼠髓核組織明顯減少，外層纖維環(huán)組織紊亂、斷裂。退變椎間盤細胞炎癥環(huán)境建立成功，后續(xù)實驗采用加壓組大鼠進行分析。見圖1。

圖1 大鼠椎間盤病理改變（HE×40）Figure 1 Pathological changes in the intervertebral disc of the rat model of disc degeneration（HE ×40）

2.2 髓核細胞形態(tài)觀察和表型鑒定顯微鏡下可見髓核細胞散在形成簇狀的圓形或橢圓型的細胞。原代髓核細胞貼壁很緩慢，培養(yǎng)至2 d左右，大部分原代髓核細胞貼壁擴展為圓形或短梭型，細胞體積較大，細胞質(zhì)豐富，細胞界限清晰，可見細胞質(zhì)內(nèi)囊泡。大鼠髓核細胞II型膠原免疫熒光檢測和Aggrecan免疫熒光檢測均呈明顯陽性，見圖2。

圖2 大鼠髓核細胞形態(tài)觀察和表型鑒定Figure 2 Morphology and phenotypes of the intervertebral disc cells in the rat model of disc degeneration

2.3 艾拉莫德對髓核細胞增殖活力影響的分析CCK-8檢測結(jié)果顯示，0.3、30、50 μg/mL艾拉莫德處理髓核細胞24 h，髓核細胞增殖活力與0 μg/mL比較均無明顯變化，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），100、150 μg/mL與0 μg/mL比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 CCK-8檢測艾拉莫德對髓核細胞增殖活力的影響Figure 3 Proliferation of the intervertebral disc cells in the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod

2.4 艾拉莫德對髓核細胞炎癥因子表達升高的影響3、10、20、30 μg/mL的艾拉莫德處理后，髓核細胞IL-6、TNF-α分泌量及相應基因表達量均呈濃度依賴性降低（P＜0.05）。見表1。

2.5 艾拉莫德對髓核細胞基質(zhì)金屬降解酶表達升高的影響3、10、20、30 μg/mL的艾拉莫德處理后，MMP-2、MMP-3和MMP-9分泌量及相應基因表達量均呈現(xiàn)濃度依賴性降低（P＜0.05）。見表2。

表1 艾拉莫德對髓核細胞炎癥因子表達的影響（±s,μg/mL）Table 1 Expressions of inflammatory factors in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

表1 艾拉莫德對髓核細胞炎癥因子表達的影響（±s,μg/mL）Table 1 Expressions of inflammatory factors in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

與0、0.3 μg/mL比較，*P ＜0.05；與3 μg/mL比較，#P ＜0.05；與10 μg/mL比較，△P ＜0.05；與20 μg/mL比較，☆P＜0.05

細胞因子IL-6(pg/mL)TNF-α(pg/mL)IL-6 mRNA TNF-α mRNA艾拉莫德濃度30 86.31±8.57*#△☆96.89±9.60*#△☆0.20±0.08*#△☆0.23±0.10*#△☆0 241.62±13.96 312.95±12.54 1.00±0.06 1.00±0.07 0.3 203.04±9.08 261.33±8.17 0.76±0.09 0.83±0.11 3 10 122.73±9.38*#132.52±11.46*#0.42±0.07*#0.42±0.08*#20 97.87±7.81*#△101.26±10.38*#△0.48±0.07*#△0.26±0.09*#△204.18±6.96*202.46±7.84*0.64±0.09*0.54±0.09*

表2 艾拉莫德對髓核細胞基質(zhì)降解酶表達升高的影響（±s,μg/mL）Table 2 Contents of matrix metalloproteinases(MMP)in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

表2 艾拉莫德對髓核細胞基質(zhì)降解酶表達升高的影響（±s,μg/mL）Table 2 Contents of matrix metalloproteinases(MMP)in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

與0、0.3 μg/mL比較，*P ＜0.05；與3 μg/mL比較，#P ＜0.05；與10 μg/mL比較，△P ＜0.05；與20 μg/mL比較，☆P＜0.05

MMP MMP-2(ng/mL)MMP-3(ng/mL)MMP-9(ng/mL)MMP-2 mRNA MMP-3 mRNA MMP-9 mRNA艾拉莫德濃度30 92.49±7.19*#△☆7.87±1.42*#△☆37.19±3.62*#△☆0.23±0.10*#△☆0.25±0.09*#△☆0.22±0.08*#△☆0 292.14±12.03 20.24±1.92 83.81±4.66 1.00±0.06 1.00±0.07 1.00±0.07 0.3 289.45±10.33 18.35±0.85 78.96±6.92 0.86±0.08 0.85±0.09 0.80±0.13 3 10 153.76±12.26*#12.58±1.16*#53.28±8.36*#0.47±0.10*#0.56±0.08*#0.53±0.09*#20 109.33±7.31*#△10.72±1.24*#△42.35±7.60*#△0.58±0.11*#△0.57±0.12*#△0.56±0.11*#△203.84±11.45*13.97±1.59*64.71±7.57*0.65±0.09*0.72±0.08*0.62±0.09*

3 討 論

細胞外基質(zhì)的降解是導致椎間盤結(jié)構(gòu)和功能破壞的最直接病理過程，往往作為炎癥反應的一種具體表現(xiàn)，使椎間盤功能退變逐漸進展。正常椎間盤在受到過度的機械應力或生物化學刺激時，椎間盤內(nèi)炎癥反應啟動，包括IL-6、IL-1β和TNF-α在內(nèi)的多種炎癥因子表達升高［13］。一方面誘導椎間盤細胞內(nèi)MMP家族和ADAMTS家族基質(zhì)降解酶類的增加，加快細胞外基質(zhì)降解過程；另一方面，也抑制椎間盤細胞外基質(zhì)合成，減少新生的細胞外基質(zhì)［14］。

相關(guān)研究證明過度的機械性載荷或各種炎癥因子刺激均可誘導椎間盤內(nèi)炎癥反應［15］。本研究利用外固定加壓裝置對大鼠尾部持續(xù)靜態(tài)加壓，誘導椎間盤功能退變。Iatridis等［16］發(fā)現(xiàn)固定加壓組較單純固定組椎間盤功能退變明顯，蛋白聚糖含量顯著減少。Kroeber等［17］加壓后發(fā)現(xiàn)椎間盤體積明顯變小及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，同時觀察到椎間盤纖維環(huán)和終板的細胞死亡量增多。雖然加壓模型無法完全模擬人體真實椎間盤功能退變過程，但本研究結(jié)果已證明加壓模型可以誘導SD大鼠椎間盤功能退變，使髓核細胞炎癥因子高表達，誘導髓核細胞基質(zhì)金屬蛋白酶高表達。

本研究中艾拉莫德干預培養(yǎng)功能退變椎間盤細胞后IL-6，TNF-α表達顯著下降，且下降程度與濃度相關(guān)，提示了其在髓核細胞內(nèi)有效的抗炎作用。IL-6和TNF-α等炎癥因子始終為各類炎癥反應中的重要介質(zhì)，在多種細胞組織中都介導了炎癥反應，而且在椎間盤功能退變中發(fā)揮著重要作用［18-20］。Studer等［21］發(fā)現(xiàn)IL-6處理人椎間盤細胞，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3，13）合成顯著增加，而蛋白多糖及膠原蛋白生成則明顯減少。Ohba等［22］研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以誘導IL-6，IL-8等炎癥因子在椎間盤中的表達，而且還促進MMP、纖溶酶、尿激酶的合成。Kohno等［19］在實驗中用TNF-α誘導滑膜細胞高表達IL-6，IL-8后用艾拉莫德干預，IL-6，IL-8的表達顯著降低。上述研究與本研究結(jié)果均一致。

MMP家族是椎間盤功能退變中主要的細胞外基質(zhì)降解酶，可將椎間盤基質(zhì)的主要成分II型膠原和蛋白聚糖降解，從而破壞椎間盤的生理結(jié)構(gòu)和功能［23-24］。本研究將MMP家族作為關(guān)鍵性的椎間盤基質(zhì)降解相關(guān)指標，結(jié)果顯示艾拉莫德可以顯著抑制退變髓核細胞中MMP-2、MMP-3、MMP-9的表達。本研究探索艾拉莫德可能的抗炎機制，相關(guān)的熒光素酶報告基因檢測和ELISA檢測顯示，對NF-κB有著顯著的抑制作用，而且這種作用呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。Gan等［25］報道艾拉莫德可通過NF-κB和MAPK途徑抑制RANKL誘導的破骨細胞的分化和遷移；Wei等［26］報道可通過艾拉莫德抑制IL-6誘導的RANKL、IL-7和MMP-3表達的抑制作用，因此對于髓核細胞炎癥因子表達的抑制是否同樣通過多途徑進行作用，對IL-6和MMP-3的抑制是否存在級聯(lián)效應仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究顯示在體外培養(yǎng)條件下，艾拉莫德顯著抑制了髓核細胞炎癥因子的表達升高，阻斷了炎癥反應的進程，達到了延緩椎間盤早期功能退變的目的，為逆轉(zhuǎn)退變的趨勢徹底解決椎間盤功能退變的問題提供了新的可能。