馮振卿

0 引 言

目前，嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）已成為近年來癌癥免疫治療領(lǐng)域的研究熱點。CAR-T細胞已在惡性血液腫瘤取得了令人矚目的療效［1-4］。全球范圍內(nèi)已有2種治療惡性血液腫瘤的CAR-T細胞藥物相繼獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準上市，分別為Kymriah（Novartis）和Yescarta（Kite Pharma）。但現(xiàn)階段CAR-T細胞治療實體瘤尚存在療效不佳和可能出現(xiàn)的特殊毒性風(fēng)險等問題。本文針對CAR-T細胞治療實體瘤療效不佳的原因以及提升療效策略進行闡述。

1 CAR-T細胞治療實體瘤療效不佳的原因

1.1 實體瘤的異質(zhì)性實體瘤的實質(zhì)是由多個克隆來源的眾多腫瘤細胞組成，這就使得實體瘤實質(zhì)腫瘤細胞的構(gòu)成異常復(fù)雜。腫瘤細胞表面靶點抗原的表達并不完全一致；且不同腫瘤細胞上的靶點也不完全一樣，致使單一種類的CAR-T細胞難以殺傷所有腫瘤細胞，從而為選擇腫瘤特異性靶點抗原造成困難，也限制了CAR-T細胞的特異性和應(yīng)用的廣泛性。

1.2 CAR-T細胞難以歸巢和定殖在腫瘤組織內(nèi)CAR-T細胞要達到腫瘤細胞的部位需穿過細胞外基質(zhì)，再克服免疫抑制微環(huán)境等不利因素。當(dāng)CAR-T細胞到達腫瘤細胞時，數(shù)量和活性已經(jīng)減低，殺傷腫瘤細胞的效能也大為降低；特別對于腦部的腫瘤，CAR-T細胞還要穿過血腦屏障。因此，提高CAR-T細胞的歸巢能力可使CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞的能力增強。見圖1。

圖1 CAR-T細胞對腫瘤細胞的識別與殺傷Figure 1 Recognition and killing of tumor cells by CAR-T cells

1.3 實體瘤免疫抑制微環(huán)境腫瘤細胞能夠利用腫瘤抗原缺失、共刺激信號異常、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）類分子表達低下、分泌免疫抑制因子（IL-10、TGF-β、IL-33等）以及腫瘤微環(huán)境中各種免疫抑制性細胞等多種途徑抑制免疫細胞的活性，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的免疫系統(tǒng)耐受，故患者自身的免疫應(yīng)答常不能抑制腫瘤生長。

免疫檢查點是近年來腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域的熱點。腫瘤細胞通過使免疫檢查點信號異常以削弱免疫反應(yīng)，進而逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視、殺傷，如T細胞表面分子程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）和細胞毒T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）。PD-1通過與其配體PD-L1和PD-L2結(jié)合抑制T細胞增殖和IFN-γ、TNF-α、IL-2的產(chǎn)生，并降低T細胞存活率。CTLA-4通過和CD28競爭性與B7結(jié)合產(chǎn)生免疫負調(diào)控信號，抑制IL-2產(chǎn)生和細胞周期進展，進而抑制T細胞的完全活化［5］。正是由于實體瘤存在以上免疫抑制微環(huán)境，使得實體瘤的臨床免疫治療效果不佳。

1.4 CAR-T細胞的脫靶效應(yīng)CAR-T細胞在識別和破壞腫瘤細胞方面非常有效。但當(dāng)腫瘤和非腫瘤組織都存在目標(biāo)靶點時，CAR-T細胞可與清除腫瘤細胞一樣，同樣可以清除正常細胞，這就是脫靶效應(yīng)（on target/off tumor）。如靶向CD19蛋白的CAR-T細胞在識別和破壞B細胞淋巴瘤和白血病細胞時十分有效，但它也能同時破壞患者體內(nèi)所有正常的CD19+B細胞。臨床上可以通過注射多克隆人免疫球蛋白（IgGs）來糾正由于B細胞耗竭而導(dǎo)致的低免疫球蛋白狀況；但是當(dāng)靶標(biāo)在正常上皮細胞中表達時，后果可能較為嚴重。

1.5 T細胞衰竭在應(yīng)用CAR-T細胞治療實體瘤時，會存在一種不利現(xiàn)象：即進入實體瘤中的T細胞可能會因為“T細胞衰竭”而停止殺傷作用，導(dǎo)致CAR-T細胞治療實體瘤的療效不佳。研究發(fā)現(xiàn)，一種名為Nr4ɑ的轉(zhuǎn)錄因子家族在“T細胞衰竭”中發(fā)揮重要作用，給荷瘤小鼠注射Nr4ɑ缺失的CAR-T細胞，可以明顯抑制腫瘤的生長［6］。

2 提高CAR-T細胞治療實體瘤療效的策略

2.1 制備Cocktail CAR-T細胞即制備針對多個靶點的CAR-T細胞，用于殺傷表達多個靶點的異質(zhì)性腫瘤。

2.2 促進CAR-T細胞在腫瘤組織內(nèi)歸巢與聚集最近有研究發(fā)現(xiàn)了一個驅(qū)動T細胞離開淋巴組織聚集在外周以及腫瘤組織中的關(guān)鍵蛋白-Runx3［7］。Runx3可對T細胞的基因進行重編程，促使T細胞內(nèi)與組織駐留相關(guān)的基因大量表達，從而促進CAR-T細胞在腫瘤組織內(nèi)聚集。在黑色素瘤小鼠模型證明，應(yīng)用過繼性T細胞治療時，抑制Runx3基因的表達可以顯著抑制T細胞在腫瘤組織的聚集，腫瘤生長速度顯著加快；促進Runx3基因的表達，則可以顯著促進T細胞在腫瘤組織內(nèi)聚集，抑制腫瘤的生長。

CAR-T細胞要歸巢、聚集在腫瘤組織內(nèi)，還有賴于T細胞表面的趨化因子受體（chemokine receptor，CCR）與腫瘤細胞表面相應(yīng)的趨化因子識別并結(jié)合。可通過過表達T細胞CCR（如CCR2b、CCR4），或過表達腫瘤細胞趨化因子（如RANTES和IL-15）來促使CAR-T聚集在腫瘤組織［8-9］。此外，為提高CAR-T細胞的歸巢能力，也可使CAR-T細胞過表達肝素酶。通過采取腫瘤局部注射的方式可使CAR-T細胞直接進入腫瘤組織，以增強CAR-T對腫瘤細胞的直接殺傷，如肝癌采取肝動脈插管灌注，腦膠質(zhì)母細胞瘤采取顱內(nèi)注射等給藥方式［10］。

2.3 制備“雙特異性CAR-T細胞”以克服免疫抑制微環(huán)境以特異性腫瘤靶點的單鏈抗體（scFv）制備CAR，可以特異性識別、結(jié)合腫瘤細胞上的靶抗原。同時在CAR胞外區(qū)增加以PD-L1 scFv為代表的第二抗原結(jié)合位點，通過對免疫檢查點的抑制，從而降低腫瘤微環(huán)境中的免疫負調(diào)控作用，提高對腫瘤細胞的殺傷作用。

c-Met是肝細胞生長因子的高親和性受體。研究表明，c-Met可以作為肝細胞肝癌的免疫治療靶點［11］；并在此基礎(chǔ)上制備雙特異性c-met/PD-L1 CAR-T細胞。體內(nèi)試驗與體外實驗均表明，制備的雙特異性c-met/PD-L1 CAR-T細胞對c-met陽性肝癌細胞的殺傷作用明顯高于單特異性c-met CAR-T細胞。

2.4 制備“雙靶點CAR-T細胞”以避免脫靶效應(yīng)將靶向2種腫瘤靶點的2個scFv分別和共刺激信號（CD28/CD137）和激活信號（CD3ζ）連接。其中1個靶點scFv與共刺激信號相連，另1個靶點scFv與CD3ζ相連。這樣只表達1個靶抗原的正常細胞與CAR-T細胞結(jié)合后，僅能提供激活信號或者共刺激信號，無法提供足夠使T細胞活化的信號。只有當(dāng)CAR-T細胞遇到同時表達2個抗原的腫瘤細胞時，激活信號和共刺激信號方可共同作用而使CAR-T細胞活化，CAR-T細胞才能發(fā)揮腫瘤殺傷作用，同時避免了脫靶效應(yīng)。

3 CAR-T細胞治療的風(fēng)險及預(yù)防措施

CAR-T細胞的臨床治療可能帶來特殊毒性風(fēng)險，包括細胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性、B細胞減少和脫靶毒性等，這就需要采取相應(yīng)的措施，降低CAR-T細胞治療帶來的不良作用。最近新出現(xiàn)的風(fēng)險是依舊帶有復(fù)制活性的慢病毒在體內(nèi)可能侵入癌細胞。一旦癌細胞自己獲得了CAR序列，這個CAR就可與腫瘤細胞的靶點蛋白互相結(jié)合，卻不引發(fā)免疫反應(yīng)。這等同于把自己的靶點蛋白隱藏起來，使原本有效的CAR-T細胞失去了追蹤靶點。

據(jù)Nɑture Medicine報道，賓夕法尼亞大學(xué)應(yīng)用CD19 CAR-T細胞治療了1例急性淋巴細胞性白血病患者，發(fā)現(xiàn)在100%的復(fù)發(fā)白血病細胞內(nèi)，都帶有用來修飾T細胞的CD19 CAR［12-13］。這可能是CAR-T細胞多次治療腫瘤后療效不佳或產(chǎn)生耐藥性的原因之一。如何避免和預(yù)防CAR-T細胞治療可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，是值得注意的問題。如引入自殺基因來控制CAR-T細胞的不良反應(yīng)；使用抑制性CAR（iCAR）減輕CAR-T細胞的脫靶毒性等。

4 展 望

未來CAR-T細胞技術(shù)的發(fā)展還有其他優(yōu)化策略，如利用CRISPR基因編緝技術(shù)改造臍帶血T細胞，制備通用型CAR-T細胞是未來的發(fā)展趨勢，有取代目前自體性CAR-T細胞的可能。隨著CAR-T細胞治療實體瘤療效不佳原因的克服和CAR-T細胞制備技術(shù)的優(yōu)化、改進，CAR-T細胞治療實體瘤也將會取得滿意的臨床療效。