宋曉紅,劉順亮a,2,陳俊華a,李艷紅,陳 璐a,黃亮亮,曾鴻鵠

(1.桂林理工大學(xué) a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院; b.廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室;c.巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心, 廣西 桂林 541006;2.東華理工大學(xué) 水資源與環(huán)境學(xué)院,南昌 330013)

0 引 言

個人護理用品PCPs(personal care products)是潛在的環(huán)境污染物,其種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,由于大量生產(chǎn)和使用而不斷地輸入環(huán)境中,在水環(huán)境甚至水生生物體中頻繁檢出[1-2],具有潛在的生態(tài)毒性效應(yīng)、生物累積效應(yīng)、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和遺傳毒性效應(yīng)[3-5]。由于大多數(shù)PCPs極性強、易溶于水、揮發(fā)性較弱[6],所以水環(huán)境是PCPs的主要匯源地。魚類作為水環(huán)境中食物鏈的重要環(huán)節(jié),其生存與水環(huán)境息息相關(guān),對污染物較為敏感,能有效地監(jiān)測和指示水中化學(xué)物質(zhì)的生物毒性。現(xiàn)有報道表明，PCPs會影響魚類的正常代謝、行為、生長、繁殖和發(fā)育[7-9],但其生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)與免疫機制方面還存在著較多未知。

當(dāng)魚體暴露到環(huán)境污染物中時,機體會產(chǎn)生大量活性氧自由基,活性氧自由基若不及時被清除,會引起脂質(zhì)過氧化、DNA斷裂、酶失活等損傷[10],導(dǎo)致過氧化脅迫反應(yīng)和細胞氧化損傷,機體會啟動抗氧化防御體系。魚體的抗氧化體系包括多種活性氧清除物質(zhì),分為抗氧化酶類(如超氧化物歧化酶SOD、 過氧化氫酶CAT、 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST等抗氧化酶)和非酶類的抗氧化劑(如谷胱甘肽GSH等),通過檢測相應(yīng)的活性氧清除物質(zhì)生化指標(biāo)變化便可知道外源污染物對機體的毒副作用,所以活性氧清除物質(zhì)是重要的分子生態(tài)毒理指標(biāo)[11]。

禾花鯉(Procyprismera)屬鯉科小型經(jīng)濟魚類,是中國土著魚類,在南方池塘、河道等水域均有分布和養(yǎng)殖。該魚生長快、繁殖力強,是理想的水環(huán)境監(jiān)測和毒理性試驗的實驗動物。目前,國內(nèi)學(xué)者只開展了部分重金屬離子對禾花鯉的脅迫作用與毒性研究[12-13],而關(guān)于PCPs污染物對禾花鯉的氧化脅迫效應(yīng)還未見報道。且大部分PCPs類物質(zhì)生物毒性實驗只探討了單一化學(xué)物質(zhì)或幾種混合化學(xué)物質(zhì)對魚類的毒性作用, 而研究混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)更具有現(xiàn)實意義,能更真實地反映污染物在環(huán)境中的綜合毒性特征。洗發(fā)水和沐浴露作為高產(chǎn)量的生活用品,是PCPs的典型代表之一,含有表面活性劑、芳香劑、增稠劑、防腐劑等復(fù)雜成分,在日常生活中廣泛使用并隨著生活污水等進入環(huán)境,其潛在的生態(tài)效應(yīng)有待研究。本研究以禾花鯉為研究對象,以大眾品牌的沐浴露與洗發(fā)水1∶1混合液作為PCPs污染物代表,比較魚體不同組織對PCPs污染物的氧化應(yīng)激反應(yīng),并篩選特異敏感的生物標(biāo)志物指示PCPs對禾花鯉的毒性水平,為水環(huán)境中PCPs的生物監(jiān)測和生態(tài)環(huán)境效應(yīng)評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用禾花鯉購自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院桂北分院漁場,實驗用魚體長(16.33±0.30) cm, 質(zhì)量(105.22±0.05) g。實驗前暫養(yǎng)7 d(死亡率不超過5%), 自然光照,水溫23.4±0.2 ℃, 溶解氧6.0 mg/L以上, 每日定時定量投食1次(中海牌鯉魚配合飼料),實驗前停食1 d。選擇健康、活力強、個體大小均勻的實驗魚開展實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCPs污染物24 h急性暴露實驗 為貼近實際使用和環(huán)境污染情況,采用大眾常用的SFJ沐浴露與PR洗發(fā)水1∶1混合配制,作為PCPs污染物試驗液。采用水生動物體外試驗方法開展預(yù)試驗,確定PCPs污染物質(zhì)量濃度范圍,禾花鯉在PCPs污染物試驗液脅迫下96 h全活質(zhì)量濃度上限為32 mg/L。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,設(shè)置高(16 mg/L)、 中(8 mg/L)、 低(4 mg/L)3個濃度組及空白對照(充分曝氣的過濾自來水),每個實驗濃度組溶液均采用充分曝氣的過濾自來水配制,于容積100 L的聚乙烯塑料水箱中開展24 h急性暴露實驗,每個實驗濃度組隨機分配5尾禾花鯉,水溫、溶解氧等實驗條件與暫養(yǎng)時一致。

PCPs污染物暴露24 h后, 在各質(zhì)量濃度組中分別隨機取4尾魚, 置于冰盤快速解剖, 取每尾魚的肝胰臟、 肌肉、 鰓、 脾臟、 腦、 腎臟、 心臟等組織, 用置冷的生理鹽水漂洗, 除去血液,濾紙拭干, 立刻置于-80 ℃超低溫冰箱保存, 用于酶活測定。

1.2.2 酶液制備及酶活性的測定 準(zhǔn)確稱取待測組織, 按照樣品質(zhì)量∶生理鹽水體積=1∶9加入預(yù)冷生理鹽水, 冰浴勻漿, 用高速冷凍離心機于4 ℃、 2 500 r/min離心10 min, 取上清液用于酶活的測定。 超氧化物歧化酶(SOD)、 過氧化氫酶(CAT)、 總抗氧化能力(T-AOC)、 谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)、 谷胱甘肽(GSH)、 丙二醛(MDA)和總蛋白含量的測定均采用試劑盒法(購自南京建成生物技術(shù)有限公司)。每個組織樣品酶活的測定重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)(n=4)表示,運用SPSS Statistics 17.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),并用Duncan氏檢驗法進行多重比較,差異顯著水平為P<0.05,極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與討論

禾花鯉暴露于不同濃度PCPs污染物24 h后,肝胰臟、鰓、脾臟、腎臟等組織T-AOC、SOD、CAT、MDA、GST、GSH的活性發(fā)生了不同程度的變化。

2.1 T-AOC的組織分布

禾花鯉在PCPs污染物脅迫24 h后, 各器官組織T-AOC活性變化如圖1所示。 禾花鯉不同組織器官T-AOC活性不同, 腦組織中含量最高, 其次是鰓、 腎臟、 脾臟, 肝胰臟、 心臟和肌肉的T-AOC活性相對較低,具有組織分布特異性。質(zhì)量濃度4 mg/L組中禾花鯉心臟T-AOC活性略微降低, 濃度增加到8 mg/L時呈現(xiàn)誘導(dǎo)現(xiàn)象, T-AOC活性極顯著增加(P<0.01), 而當(dāng)濃度繼續(xù)增大時, 心臟的T-AOC活性又顯著被抑制(P<0.05)。隨濃度的增加,腦組織、腎臟、鰓組織和肌肉中T-AOC活性均呈現(xiàn)出不同程度的下降趨勢,與空白組對比,抑制率介于9.84%～89.02%,說明PCPs污染物對T-AOC產(chǎn)生了抑制作用,可破壞組織的氧化還原狀態(tài),引起細胞功能的紊亂。譚樹華等[14]、張春玲等[15]均報道了T-AOC與染毒劑量的負相關(guān)關(guān)系,與本文結(jié)果一致。

圖1 PCPs脅迫24 h后禾花鯉不同組織的T-AOC活性Fig.1 T-AOC activity in different tissues of Procypris meraafter 24 h exposure to PCPs*P<0.05表示與空白對照組比較有顯著性差異,**P<0.01表示與空白對照組比較有極顯著差異(下同)

T-AOC包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng),機體防御體系的T-AOC代表了體系內(nèi)的各種抗氧化分子和酶的總水平,其強弱與健康程度存在密切聯(lián)系。當(dāng)禾花鯉接觸到高劑量PCPs時,機體會產(chǎn)生大量活性氧,攻擊魚體和抗氧化酶,而其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶活性增加不足以抵消抗氧化酶的嚴(yán)重損傷,導(dǎo)致酶活性降低[16],T-AOC活性的降低說明活性氧的產(chǎn)生已經(jīng)超出抗氧化防御系統(tǒng)的能力,可能會對機體造成損傷。通過檢測腦組織和腎臟中T-AOC活性的變化可有效指示PCPs污染物對魚體的生理毒性。

2.2 SOD的組織分布

圖2 PCPs脅迫24 h后禾花鯉不同組織的SOD活性Fig.2 SOD activity in different tissues of Procypris meraafter 24 h exposure to PCPs

2.3 CAT的組織分布

不同濃度PCPs污染物暴露后不同組織CAT活性的變化如圖3所示。 在脅迫反應(yīng)期間， 心臟和肌肉組織的CAT活性較低， 其余各器官組織中CAT活性介于2.46～31.74 U/mgprot, 不同器官組織CAT活性不同, 主要分布于肝胰臟, 存在集中表達的現(xiàn)象。CAT可催化H2O2分解為H2O與O2,降低H2O2反應(yīng)生成有害的·OH的概率,在降低活性氧自由基對機體細胞的氧化損傷方面起著重要作用[18]。比較不同濃度污染物對肝胰臟、腎臟和鰓中CAT活性的影響發(fā)現(xiàn),各濃度組CAT活性與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)。CAT只能在高H2O2情況下才發(fā)揮作用[19],說明魚體沒有產(chǎn)生大量H2O2,這也與SOD的活性變化相吻合。盡管CAT反應(yīng)變化不強烈,但CAT活性依然受到了不同程度的誘導(dǎo)或抑制。在8 mg/L PCPs作用下,各組織CAT活性相比空白對照組均有所下降,說明該濃度PCPs暴露對CAT活性影響較大。在肝胰臟和脾臟中,低水平的PCPs消耗了機體中的CAT酶,CAT活性有所下降,而在高濃度組,機體本身的清除能力不足,需誘導(dǎo)CAT酶的表達和合成,所以16 mg/L濃度組CAT活性又有所增加。

圖3 PCPs脅迫24 h后禾花鯉不同組織的CAT活性Fig.3 CAT activity in different tissues of Procypris mera after 24 h exposure to PCPs

2.4 MDA的組織分布

MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物,可根據(jù)其含量高低評判細胞膜脂過氧化的程度,間接反映細胞損傷大小。PCPs脅迫24 h后,隨污染物濃度增加,鰓組織和肝胰臟中的MDA含量呈下降趨勢,但肝胰臟中差異不顯著(P>0.05)(圖4)。心臟和腦組織中MDA含量較低，肌肉和脾臟組織中呈現(xiàn)先下降后恢復(fù)的現(xiàn)象,而腎臟中MDA含量則先上升再下降,說明PCPs對不同組織細胞膜的破壞程度不同。8 mg/L PCPs作用下腎臟中MDA含量顯著增加,說明該組織內(nèi)有較多脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛積累。鰓是魚體重要的免疫器官,與PCPs直接接觸,對鰓的影響更大, MDA含量隨著劑量增加而下降, 可能是因為高質(zhì)量濃度的PCPs對動物機體產(chǎn)生了大量活性氧, 過多的活性氧破壞了細胞內(nèi)多種酶系統(tǒng)和功能膜, 導(dǎo)致MDA含量受到抑制而下降[20]。 禾花鯉鰓組織中MDA活性的變化可以反映出PCPs對魚體鰓組織的損傷作用, 可將其作為PCPs污染的有效指標(biāo)。

2.5 GST的組織分布

不同濃度的PCPs脅迫對禾花鯉各組織GST活性的影響如圖5所示。GST廣泛分布于各個組織。當(dāng)PCPs濃度為8 mg/L時,禾花鯉鰓、肝胰臟、腎臟和脾臟4個免疫器官的GST活性顯著升高,達到峰值,說明此時各組織受到的氧化損傷加劇,魚體通過自身的抗氧化防御體系大量誘導(dǎo)GST表達以增強自身清除自由基的解毒能力,緩解細胞自身所受到的氧化損傷。PCPs濃度為16 mg/L時,GST活性下降。隨著暴露濃度的增大,機體的抗氧化能力不足以應(yīng)對更為嚴(yán)重的氧化脅迫,所以GST活性降低,機體受到了氧化損傷。這種低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的現(xiàn)象與多篇報道一致,是典型的拋物線型劑量效應(yīng)關(guān)系,即“毒物興奮效應(yīng)”[19,21-22]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)能催化谷胱甘肽(GSH)與某些外源性或體內(nèi)有害化學(xué)物質(zhì)的親電子基團相結(jié)合,最終形成硫醚氨酸排出體外,在消除生物體內(nèi)過氧化物和解毒功能方面具有重要作用。GST活力的大小可以反映生物機體的抗氧化能力,可將GST活性的變化作為檢測環(huán)境中PCPs污染的生化指標(biāo)。

圖5 PCPs脅迫24 h后禾花鯉不同組織的GST活性Fig.5 GST activity in different tissues of Procypris mera after 24 h exposure to PCPs

2.6 GSH的組織分布

不同濃度的PCPs脅迫24 h后,禾花鯉各組織GSH活性的變化如圖6所示。禾花鯉不同器官組織GSH活性不同,存在組織特異性,主要分布于鰓組織和肝胰臟,且表達量較高,峰值達到114.46 mg/gprot,是其他組織含量的1.3～52.2倍。由此可知,鰓組織和肝胰臟是GSH的主要反應(yīng)器官。

圖6 PCPs脅迫24 h后禾花鯉不同組織的GSH活性Fig.6 GSH activity in different tissues of Procypris mera after 24 h exposure to PCPs

禾花鯉鰓組織和肝胰臟中GSH活性也呈現(xiàn)了“毒物興奮效應(yīng)”,當(dāng)PCPs質(zhì)量濃度為4 mg/L時,鰓組織的GSH活性急劇升高(P<0.01),肝胰臟GSH活性也有所增加,說明PCPs對鰓組織和肝胰臟中的GSH活性具有誘導(dǎo)作用;當(dāng)PCPs質(zhì)量濃度為8 mg/L時,其對鰓組織和肝胰臟中的GSH活性的抑制作用顯著。當(dāng)PCPs質(zhì)量濃度為16 mg/L時,鰓組織和肝胰臟中GSH活性有所回升,但鰓組織中GSH活性依然顯著小于空白對照組(P<0.05),抑制效應(yīng)依然存在。機體受到低濃度脅迫時,活性升高,但受到重度脅迫時,活性降低,與亞硝態(tài)氮對草魚肝細胞中GSH的影響變化一致[23]。

3 結(jié) 論

當(dāng)生物體內(nèi)活性氧與抗氧化防御系統(tǒng)之間不平衡時,會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。T-AOC、SOD、CAT、MDA、GST、GSH是機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要物質(zhì),在清除自由基中發(fā)揮重要的作用。本文研究了不同濃度PCPs污染物24 h脅迫對禾花鯉不同組織抗氧化系統(tǒng)的影響,結(jié)論如下:

(1)魚類不同器官組織抗氧化活性不同,與器官組織的生理功能和代謝水平有關(guān),T-AOC、CAT和GSH活性具有組織分布特異性。

(2)不同濃度PCPs污染物24 h脅迫后,魚體抗氧化系統(tǒng)呈現(xiàn)不同程度的誘導(dǎo)或抑制現(xiàn)象,其中鰓組織和肝胰臟中GSH和GST均呈現(xiàn)了“毒物興奮效應(yīng)”,機體受到低濃度脅迫時活性升高,受到重度脅迫時活性降低。

(3)禾花鯉鰓組織中GST、GSH、MDA,肝胰臟中的GST,腎臟中T-AOC、GST和腦組織的T-AOC,對不同濃度PCPs污染物的反應(yīng)比較靈敏,可作為生物標(biāo)志物有效指示PCPs污染物脅迫對魚體的生理毒性。