周冰，徐巖松，侯麗麗，謝耀萍，付鵬

肺結(jié)核又稱為癆病，是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的慢性炎性疾病，全球病人數(shù)量每年以數(shù)百萬的速度增加，由于結(jié)核桿菌感染而導(dǎo)致死亡的人數(shù)在感染性疾病中居第二位[1-2]。同時(shí)有些病人感染結(jié)核桿菌后并不會(huì)立即發(fā)病，當(dāng)機(jī)體的免疫力下降或變態(tài)反應(yīng)增強(qiáng)時(shí)，才表現(xiàn)出肺結(jié)核癥狀，全世界范圍內(nèi)有1/3的人的結(jié)核分枝桿菌處于潛伏感染期[2-3]。中國有近50%的人感染結(jié)核桿菌，結(jié)核桿菌已成為肺結(jié)核新發(fā)病例的主要病原菌，因此對(duì)肺結(jié)核病人進(jìn)行早期的診斷和治療具有重要意義[4]。目前臨床上診斷方法主要包括細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞因子檢測(cè)、抗原檢測(cè)等，但是這些方法具有耗時(shí)長(zhǎng)，可能出現(xiàn)假陰性，對(duì)樣品要求高等缺點(diǎn)，會(huì)干擾肺結(jié)核的及時(shí)診斷和治療[1，5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro RNA，miRNA)在結(jié)核病病人外周血中穩(wěn)定存在，其表達(dá)水平會(huì)升高或者降低，參與肺部疾病的發(fā)生及發(fā)展，能夠調(diào)控基因表達(dá)，作為新的生物標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)[6]，隨著對(duì)miRNA的研究不斷深入，有研究[4]證實(shí)微小RNA-144(mir-144)的表達(dá)水平與宿主的免疫功能聯(lián)系密切，但其臨床意義并未深入研究。本研究通過檢測(cè)活動(dòng)期肺結(jié)核病人外周血中mir-144的表達(dá)水平及臨床意義，旨在為臨床診斷活動(dòng)期肺結(jié)核提供新的方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年1月至2017年4月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科收治的活動(dòng)期肺結(jié)核病人98例，所有病人胸部X線掃描發(fā)現(xiàn)病灶，并經(jīng)細(xì)菌學(xué)診斷均呈陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；②臨床資料完整，且依從性高；③經(jīng)病人及其近親屬同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎臟器病變；②患有糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等全身免疫性疾??；③入組前曾使用影響免疫功能的藥物；④中途退出的病人。活動(dòng)期肺結(jié)核組中男69例，女29例；年齡(50.23±6.02)歲，年齡范圍為26～75歲；體質(zhì)量指數(shù)(22.08±1.25)kg/m2，體質(zhì)量指數(shù)范圍為19.87～24.62 kg/m2；病程為(3.02±1.17)個(gè)月，病程范圍為1～6個(gè)月。另外選擇同期進(jìn)行體檢的健康志愿者62例作為對(duì)照組，其中男40例，女22例；年齡為(50.09±5.65)歲，年齡范圍為25～73歲；體質(zhì)量指數(shù)為(21.97±1.13)kg/m2，體質(zhì)量指數(shù)范圍為19.43～24.67 kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，研究過程均符合相關(guān)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1樣品收集及RNA提取 受試者均空腹抽取外肘靜脈血2 mL，置于涂有肝素鈉的采血管中，30 min內(nèi)將200 μL全血裝入含有Trizol 和研磨珠的凍存管中，充分振蕩均勻后，置于-80 ℃冰箱中備用待測(cè)。參照Trizol Reagent試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取血液中總RNA，使用適量核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)水充分溶解RNA，應(yīng)用核酸測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度，RNA的完整性檢測(cè)使用瓊脂糖凝膠電泳分析，調(diào)整其濃度后，置于 -80 ℃冰箱中保存。

1.2.2熒光定量PCR 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取20 μL待測(cè)樣品，包括1 μL總RNA，分別取5份反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、1份反轉(zhuǎn)錄酶1 μL和4份RNase水14 μL，在37 ℃下反應(yīng)1 h，然后在95 ℃下反應(yīng)5 min。mir-144引物序列為5′-ATCCAGTGCGTGTCGTCGTG-3′(由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成)，具體的條件：在95 ℃下預(yù)變性5 min；變形和延伸的溫度為95 ℃，時(shí)間為5 s；60 ℃反應(yīng)20 s；72 ℃反應(yīng)20 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；78 ℃下反應(yīng)20 s進(jìn)行熒光收集。內(nèi)參為管家基因U6，采用相對(duì)定量法計(jì)算外周血中mir-144的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3血漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達(dá)水平檢測(cè) 受試者均空腹抽取外肘靜脈血3 mL，置涂有肝素鈉的采血管中，以3 500 r/min的速度離心10 min，離心半徑為3 cm，分離上清液，即得血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)比較血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平，另外分析活動(dòng)期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達(dá)水平和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平的相關(guān)性。根據(jù)研究數(shù)據(jù)繪制血漿mir-144診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的受試者工作特征曲線(ROC)，計(jì)算曲線下面積，用最大約登指數(shù)法確定血漿mir-144診斷活性期肺結(jié)核的的截?cái)嘀担?jì)算用此截?cái)嘀翟\斷活動(dòng)性肺結(jié)核的靈敏度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平的比較活動(dòng)期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組mir-144、TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平的比較

2.2 血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平的相關(guān)性活動(dòng)期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達(dá)水平與血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.718、-0.709、-0.723，P=0.019、0.022、0.018)。數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖見圖1。

圖1 血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平的相關(guān)散點(diǎn)圖

2.3 mir-144的診斷意義根據(jù)本研究數(shù)據(jù)繪制血漿mir-144診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線(圖2)，曲線下面積為0.944，用最大約登指數(shù)法確定血漿mir-144診斷活性期肺結(jié)核的截?cái)嘀禐?.47，用其診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別為96.88%(155/160)和96.77%(60/62)。

圖2 血漿中mir-144診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線

3 討論

結(jié)核分枝桿菌作為細(xì)胞內(nèi)致病菌，其宿主一旦被感染，激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，結(jié)核分枝桿菌與Toll樣受體作用，通過激活多種信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎及抑菌效應(yīng)[7]。結(jié)核分枝桿菌通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路而上調(diào)TNF-α、IL-10及MCP-1的合成量，前炎性因子激活巨噬細(xì)胞，加強(qiáng)其吞噬作用，殺死病菌，提高抗結(jié)核的活性，結(jié)核的免疫類型主要為巨噬細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫過程，結(jié)合感染的過程中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生特異性miRNA，并且在肺結(jié)核病人血液中檢測(cè)到miRNA[8-9]。miRNAs由21～25個(gè)核苷酸組成，主要在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，雖然在人類基因總數(shù)中占比不足5%，但是卻可以調(diào)控超過30%的基因。

miRNAs參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞凋亡和死亡等過程，同時(shí)miRNA對(duì)免疫細(xì)胞分化、信號(hào)傳導(dǎo)及免疫應(yīng)答等免疫反應(yīng)的多層面能夠進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)[6，10]。血液中miRNAs能夠作為多種疾病如胃癌等的生物學(xué)早期診斷指標(biāo)，目前對(duì)于 mir-144的研究主要集中在血液系統(tǒng)疾病上，對(duì)于炎性疾病，尤其是結(jié)核病的研究并不多見[6，11]。另外潛伏期肺結(jié)核的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)呈陽性，但是影像學(xué)檢查結(jié)果與正常人差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有超過85%的活動(dòng)期肺結(jié)核病人是由潛伏期肺結(jié)核演變來的，因此準(zhǔn)確判斷潛伏期的肺結(jié)核對(duì)于預(yù)防和控制活動(dòng)期肺結(jié)核具有重要意義[5]。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的非編碼RNA主要包括短小RNA、miRNA及小分子RNA等[12-13]，miRNA在臨床樣本中的穩(wěn)定性高，并且可以快速準(zhǔn)確定量，有望成為非創(chuàng)傷性生物學(xué)指標(biāo)來反映疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，miRNA目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于心臟病、糖尿病及感染性疾病中[3，13-14]。miRNA來源于內(nèi)源性染色體，由長(zhǎng)度為70～80核苷酸的單鏈RNA組成的短序列，其存在形式分為單拷貝、多拷貝或基因簇，并且多存在于基因間隔區(qū)，獨(dú)立性較強(qiáng)，不能翻譯成蛋白質(zhì)，主要是通過降解對(duì)應(yīng)mRNA影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，調(diào)控機(jī)體的代謝過程[5]。結(jié)核分枝桿菌通過影響miRNA的表達(dá)水平影響細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)核病人血清中1 223種miRNA的表達(dá)水平，其中59種miRNA表達(dá)水平升高，而33種miRNA表達(dá)水平降低，提示miRNA對(duì)于評(píng)價(jià)結(jié)核病的診斷及治療效果具有重要作用[3]。

研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，說明mir-144能夠用于反映肺結(jié)核的發(fā)生和發(fā)展，另外血漿mir-144診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線下面積為0.944，截?cái)嘀禐?.47，同時(shí)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別為96.88%和96.77%，提示使用mir-144診斷活動(dòng)期肺結(jié)核意義重大。機(jī)體感染結(jié)核桿菌后，機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子等物質(zhì)的釋放，主要包括TNF-α、IL-10及MCP-1，對(duì)于結(jié)核病的發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，TNF-α、IL-10及MCP-1是體內(nèi)促炎因子，影響活動(dòng)性肺結(jié)核，從而清除結(jié)核分枝桿菌的病原體[7，16]。結(jié)果表明活動(dòng)期肺結(jié)核病人血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組病人，說明結(jié)核桿菌激活機(jī)體的免疫防御機(jī)制，上調(diào)細(xì)胞因子的釋放量。相關(guān)性研究結(jié)果表明血液中mir-144的表達(dá)水平與血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。mir-144主要在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫過程[10]，有研究證實(shí)[17]，mir-144在活動(dòng)性肺結(jié)核病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)水平高于健康志愿者，可能是通過抑制淋巴T細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)抗結(jié)核免疫反應(yīng)。另外miRNA主要影響MAPK和NF-κB等信號(hào)通路，結(jié)核桿菌可能通過miRNA調(diào)控的信號(hào)通路，抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，感染性疾病的機(jī)體內(nèi)的病毒通過基因沉默機(jī)制“逃脫”免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，依賴miRNA抵抗機(jī)體的免疫反應(yīng)[5，7]。

綜上所述，活動(dòng)期肺結(jié)核病人外周血中mir-144的表達(dá)水平異常降低，并且與TNF-α、IL-10及MCP-1呈負(fù)相關(guān)，臨床診斷價(jià)值高，為今后研究活動(dòng)期肺結(jié)核的預(yù)防和診斷提供新的思路和方法。