張飛虎, 于燕子, 張 勝, 李湘洲

(中南林業(yè)科技大學 材料科學與工程學院，長沙 410004)

0 引 言

指紋圖譜分析是一種綜合、定量，基于天然產(chǎn)物化學成分研究基礎(chǔ)上的檢測方法，一般采用高效液相色譜法結(jié)合分析軟件進行，指紋圖譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用在中藥生產(chǎn)過程控制中[1]，可以有效地解決生產(chǎn)中內(nèi)在質(zhì)量控制問題，保證中藥制劑的藥物作用。同時其也大量應(yīng)用于不同來源物種的鑒別分析。指紋圖譜常見的分析方法有非線性映射[2]、聚類分析[3]、相似性分析[4]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[5]和重疊率分析[6]等。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是將高效液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)而成的儀器。高效液相色譜將樣品中成分分離，質(zhì)譜提供成分的相對分子量，從而獲得化學成分的信息。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用整合了高效液相色譜高分離和質(zhì)譜高鑒別的特點，是天然活性成分研究的重要技術(shù)手段[7-8]，在實驗教學中常與指紋圖譜配合使用。

竹是一種重要的非木本森林資源，含有多種活性成分，竹葉提取物的低毒性和其廣泛的藥理活性，吸引了大量研究者的研究興趣[9]。關(guān)于竹葉活性成分質(zhì)量控制的兩個主要方法：一種是用指紋圖譜分析的方法，可提供樣品完整的化學成分信息[10-11]；而另一種是基于特定的活性成分，對其進行分析研究[12-13]。如黃酮(葒草苷、異葒草素、牡荊素和異牡荊)[14]、酚酸(咖啡酸和綠原酸)[15]的含量。

本文將校園中常見6種竹的葉片進行高效液相指紋圖譜分析所獲得的數(shù)據(jù)進行了比較分析化學成分差異，讓學生掌握指紋圖譜分析在天然活性成分分析中的應(yīng)用。對于有深入研究興趣的同學，向他們展示運用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對具有地域特點的長沙青皮竹竹葉的具體成分進行鑒定，讓學生了解高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在天然活性成分研究中的應(yīng)用。

1 實驗方法

1.1 實驗儀器與材料

指紋圖譜分析的儀器為美國安捷倫公司生產(chǎn)的高效液相色譜儀(型號：Agilent1260)，配有紫外檢測器與四元液相泵；用于液相-質(zhì)譜分析的儀器為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號：API QSTAR Pulsar)，配備四極桿/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜。實驗用乙腈、甲醇為色譜純，甲酸、磷酸為分析純。實驗用水為超純水。

6種竹葉采自中南林業(yè)科技大學校園內(nèi)，經(jīng)中南林業(yè)科技大學林學院陳建華教授鑒定分別為長沙青皮竹(Bambusatextilisvar.persistens. B.M.Yang)；水竹(PhyllostachysheterocladaOliver)；假毛竹(Phyllostachyskwangsiensis)；琴絲竹(Phyllostachysaureosulcata)；斑竹(Phyllostachysbambusoidescv. Lacrima-Deae)；毛竹(Phyllostachysheterocyclacv. Pubescens)。上述竹葉樣品依次編號為S1，S2，S3，S4，S5，S6。

1.2 樣品的制備

竹葉收集后在陰涼處干燥，用植物粉碎機將竹葉粉碎成粗粉。分別稱取粗粉2 g，加甲醇100 mL，回流提取2 h。將提取液濃縮至10 mL，然后用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取濾液進樣。

1.3 指紋圖譜分析條件

反相C18柱(長度與直徑：250 mm×4.6 mm，填料粒度：5 μm)；流動相為0.1%磷酸(A)和乙腈(B)。洗脫條件：初始比例A相為88%，B相為12%；0～30 min之內(nèi)A相由88%降低至84%，B相由12%升至16%；30～60 min之內(nèi)A相由84%降低到75%，B相由16%升至25%；60～80 min之內(nèi)A相由75%降低至40%，B相從25%升至60%。流速：1.0 mL/min，各樣品的進樣量為10 μL，檢測波長330 nm。使用國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(版本號：2004A)對色譜圖進行分析。

1.4 高效液相色譜-質(zhì)譜條件

反相C18柱(長度與直徑：100 mm×2 mm，填料粒度：5 μm)；流動相為0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。洗脫條件：0 min：90%A，10%B；0～20 min，90%A→70%A，10%B→30%B；20～22 min：70%A→0，30%B→100%B；22～25 min：100%B。流速：0.20 mL/min, 各樣品的注射量為10 μL。波長為330 nm。質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式，毛細管電壓3.5 kV，噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力0.11 MPa，輔助氣柱前壓68 kPa，干燥溫度450 ℃，干燥氣體流速為8.0 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜相似性評價

6種竹葉的色譜圖見圖1，共有峰的相對面積和保留時間分別見表1和2，相似性分析結(jié)果見表3。

圖1 6種竹葉的色譜圖

由表1可知，6種竹葉色譜圖中有8個共有峰。以最大峰面積的7號峰為對照，峰面積設(shè)為1，每個竹葉圖譜中的其他共有峰與之相除得到相對峰面積。表2則提供了8個共有峰出峰的保留時間。由表內(nèi)數(shù)據(jù)可知，每個竹葉色譜圖中共有峰的保留時間的標準差(SD)均<1。說明這些峰的選取符合共有峰的特點。指紋譜圖的相似性是一個量化的參數(shù)。該參數(shù)結(jié)合了色譜圖中共有峰的重疊率和峰面積強度。每對樣品色譜圖之間的相似性體現(xiàn)了化學成分的差異性(見表3)。相似性范圍在0～1之間，值為1時表示圖譜是相同的，值為0則表示圖譜完全不同。通過相似性評價系統(tǒng)計算了6種竹葉的色譜指紋圖譜之間的相似性。長沙青皮竹的色譜圖與水竹相似性最大，為0.992，說明兩者化學成分很相似。長沙青皮竹和斑竹色譜圖之間的相似性最小，為0.209，說明兩者化學成分有很大的不同。

表1 共有峰的相對峰面積

表2 共有峰的保留時間 min

表3 竹葉指紋圖譜的相似性分析

2.2 長沙青皮竹化學成分

長沙青皮竹樣品通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀獲得色譜的圖見圖2，質(zhì)譜分析通過相對分子質(zhì)量可鑒定出8個成分，見表4。成分多為黃酮類，符合竹葉化學成分的一般規(guī)律。

圖2 長沙青皮竹葉液相色譜-質(zhì)譜分析圖

3 結(jié) 語

本實驗通過指紋圖譜分析對不同來源的6種竹類植物葉片化學成分的差異進行了比較，為竹葉的化學成分評價提供了一個新的視角。另外，通過高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對具有地域特點的長沙青皮竹中的化學成分進行鑒定分析。

實驗教學是林產(chǎn)化工專業(yè)培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。竹葉指紋圖譜分析實驗課共8 學時， 其中4 學時進行高效液相色譜實驗， 另外4 學時進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的講解和操作，指紋圖譜的數(shù)據(jù)分析由學生在課后進行分析。該實驗主要是色譜分析與質(zhì)譜分析的應(yīng)用，同時還涉及了數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的知識，綜合性與實踐性強， 可全面提升學生的科研能力和實驗操作能力。