陳雅琪，吳燕，黃一凡，文彬

(川北醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室·川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000)

食管癌是消化道常見惡性腫瘤，我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，高發(fā)區(qū)發(fā)病率約121/1萬，是世界低發(fā)病率地區(qū)的20倍以上，每年新發(fā)病例27萬以上，其中超過20萬的患者死亡，死亡率居第四位[1-2]，食管癌早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是中晚期，患者預(yù)后差，若能早期發(fā)現(xiàn)食管癌，能極大減輕患者痛苦，提高生存率。ARTN是膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一的蛋白編碼基因，ARTN與下游的GFRα3及RET形成復(fù)合物，激活SMAD家族轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，ARTN蛋白在多種惡性腫瘤中表達，并發(fā)揮一定生物學(xué)作用，但ARTN與食管鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系上不明確。本實驗通過檢測ARTN在食管鱗癌中的表達，來探討ARTN與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 免疫組化標(biāo)本 收集2009年1月1日至2010年9月30日川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院存檔確診的食管鱗狀細(xì)胞癌包埋石蠟樣本本114例，患者年齡39～82歲，高級別上皮內(nèi)瘤變樣本17例，年齡42～75歲，食管正常組織25例(以無腫瘤的切緣替代)作對照，年齡49～78歲。

1.1.2 Western blot標(biāo)本 選取2014年3月至2014年6月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科手術(shù)切除的新鮮食管腫瘤組織及配對的距腫瘤>5 cm的正常組織12例，年齡42～72歲，其中男性9例，女性3例，術(shù)后均確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；切除后置于冰上，生理鹽水沖洗后以100 mg每份分裝于冷凍管，置于冷凍盒中于-80 ℃冰箱保存。

所有標(biāo)本術(shù)前均未經(jīng)放化療，與患者或家屬簽署相關(guān)知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 免疫組化

ARTN兔抗人多克隆抗體購自Abcom公司(稀釋濃度1∶50)，所選蠟塊冷凍后每個切白片3 μm厚，以胰腺癌標(biāo)本做陽性對照，組織本身做陰性內(nèi)對照，采用SP兩步法檢測ARTN蛋白的表達。ARTN陽性信號呈棕黃色顆粒，表達于鱗狀上皮細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判讀由ARTN陽性染色范圍及著色強度共同確定評分。陽性染色范圍以陽性細(xì)胞所占百分比劃分，無細(xì)胞著色判為0分；<25%為1分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。著色強度無色為0分；著色淺黃為1分；棕黃為2分；棕褐為3分。總分將兩者分?jǐn)?shù)相加，由兩位副高及以上級別病理醫(yī)師共同打分，最后取平均分，≤2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.3 Western blot檢測

蛋白提取，BCA蛋白濃度測定，凝膠配置試劑盒、上樣緩沖液、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、PVDF膜、超敏ECL發(fā)光液購于碧云天公司。操作按試劑盒說明進行，取食管鱗癌組織，癌旁組織各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混勻，冰上裂解，低溫離心，取上清液分裝，上清液按4∶1加電泳緩沖液于PCR儀上99 ℃變性15 min，與配置好的凝膠上樣電泳，濃縮膠80 V至分離膠時，改為120 V電泳至分離膠底部，剪裁與膠相適大小PVDF 膜，甲醇中活化15 s，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉3 h；4 ℃冰箱內(nèi)一抗(ARTN濃度1∶3 000，GAPDH濃度1∶2 000)過夜，次日常溫二抗(1∶5 000)60 min，ECL發(fā)光，圖像采集。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同食管組織中ARTN蛋白的表達

ARTN蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃或棕褐色。ARTN蛋白在正常食管黏膜上皮中不表達，在高級別上皮內(nèi)瘤變組織和食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達率分別為23.5%及80.7%。癌組織陽性表達率明顯高于高級別上皮內(nèi)瘤變及正常食管黏膜上皮。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1和表1。

表1 不同食管組織中ARTN表達情況

注：N為正常組織，H為高級別上皮內(nèi)瘤變組織，ESCC為食管鱗狀細(xì)胞癌組織。*P<0.05，與H比較；#P<0.01，與ESCC比較；△P<0.01，與N比較。

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌中ARTN蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

114例食管鱗狀細(xì)胞癌中，男性89例，女性25例；年齡39～82歲，中位年齡57歲。統(tǒng)計ARTN蛋白與患者病例參數(shù)之間的關(guān)系，ARTN表達與浸潤深度，TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 Western檢測ARTN蛋白在新鮮食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達

手術(shù)室搜集新鮮標(biāo)本，術(shù)后病理均確診為食管鱗狀細(xì)胞癌組織12例，搜集配對的癌旁組織(與癌組織距離﹥5 cm)。Western blot檢測以分子量36 KD的GAPDH作內(nèi)參，相對表達量以ARTN與GAPDH灰度值比值表示，觀察ARTN蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARTN蛋白在食管鱗癌組織和正常組織中均有不同程度的表達，但在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織中，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

表2ARTN蛋白的表達與食管鱗狀細(xì)胞癌病理特征的關(guān)系

2.4 生存分析

為評價ARTN的表達與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系，本次實驗通過電話對患者進行回訪，以手術(shù)出院之日至滿5年，共獲得39例資料。其中18例存活，總生存率46.2%。ARTN陽性表達的30例，11例存活,5年生存率為36.7%(11/30)。陰性表達占9例，7例存活，5年生存率77.8%(7/9)，ARTN陽性表達組五年生存率明顯低于陰性表達組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤，世界各地由于癌癥引起患者死亡的原因中，食管癌居第六位，每年新增病例超過48萬例[5]，食管癌組織學(xué)分類分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagus squamous cell carcinoma，ESCC)及食管腺癌(esophagus adenocarcinoma，EAC或EAD)，歐美國家，食管腺癌的發(fā)生率有所升高，但仍以食管鱗癌為主，占80%以上[6-7]，治療方式包括手術(shù)，放化療及聯(lián)合治療，治療方式的選擇主要根據(jù)臨床TNM分期來確定，早期T1a期或更早的高級別上皮內(nèi)瘤變患者可采用內(nèi)鏡下粘膜剝除術(shù)，而避免食管切除術(shù)帶來的手術(shù)創(chuàng)傷，和由其增加的死亡率[8]。膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)家族成員包含四個因子， ARTN為其中之一，ARTN與其特異性配體GFRα1/ GFRα3(糖基化磷脂酰肌醇細(xì)胞膜受體1、3)形成復(fù)合體，其中與GFRα3的作用尤為明顯，再與絡(luò)氨酸激酶受體(RET)結(jié)合，通過三種途徑向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號，除維持機體神經(jīng)元存活，促進神經(jīng)及上皮細(xì)胞的生長，分化和趨藥性方面發(fā)揮重要作用外，也與惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，既往研究發(fā)現(xiàn)，ARTN與多種惡性腫瘤相關(guān)，女性生殖系統(tǒng)腫瘤多與激素相關(guān)，而激素與目前腫瘤的治療密切相關(guān)，ARTN在女性生殖系統(tǒng)腫瘤如乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌中表達，除與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，浸潤轉(zhuǎn)移等臨床病理因素有關(guān)外，更與激素及藥物治療關(guān)系密切[9-11];呼吸系統(tǒng)腫瘤，ARTN在喉鱗癌，肺非小細(xì)胞癌中表達上調(diào)，與喉癌TNM分期及預(yù)后相關(guān)， 肺非小細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分期相關(guān)[12-13];消化系統(tǒng)腫瘤，ARTN在食管鱗癌細(xì)胞株表達上調(diào)，并促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲，與胃腺癌浸潤深度、TNM分期相關(guān)，在腸腺癌，ARTN與腫瘤分化程度，浸潤深度，Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，另在肝細(xì)胞肝癌，胰腺癌中均有表達，且發(fā)揮一定生物學(xué)作用[14-17]。但ARTN與食管鱗癌中的臨床病理聯(lián)系、預(yù)后等作用尚不明確，本次實驗初步探索ARTN在正常食管組織，高級別上皮內(nèi)瘤變組織及食管鱗癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高級別上皮內(nèi)瘤變組織與正常組織相比，ARTN表達升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，食管鱗癌中，ARTN表達更高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；另Western-blot結(jié)果ARTN在鱗癌組織中表達高于正常組織(P<0.01)，可見ARTN在腫瘤中表達升高，這與ARTN作為一種癌癥干細(xì)胞樣(cancer stem cell-like,CSC-like)作用相關(guān)，不僅具有CSC樣作用，也具有促進上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)換作用，促進腫瘤的發(fā)展，并具有更高的侵襲性[18]；此外，ARTN表達水平與腫瘤浸潤深度、臨床分期及預(yù)后相關(guān)，浸潤越深，ARTN表達程度與臨床分期呈正相關(guān)，與患者生存率呈負(fù)相關(guān)，說明ARTN促進食管鱗癌進展。細(xì)胞持續(xù)增殖和生長是癌癥的重要特征，腫瘤所處的微環(huán)境包括氧含量、血管生成等，在腫瘤的形成中起重要作用，腫瘤生長過程中，癌細(xì)胞之間的黏附能力下降，癌細(xì)胞由于黏附力下降，易脫落，從而形成轉(zhuǎn)移，而ARTN與促進缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達相關(guān)，能促進缺氧微環(huán)境，促進血管生長，從而促進腫瘤發(fā)生進展[16]，ARTN降低鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達，上調(diào)ARTN的表達，E-cadherin的表達下降，癌細(xì)胞粘附力下降，腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力增加[19]；實驗結(jié)果與ARTN作用相符。另外，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ARTN與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，這與ARTN促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用相矛盾，分析原因：(1)ARTN促進腫瘤轉(zhuǎn)移是在其某一通道上起作用，食管鱗癌中，可能不存在促進腫瘤轉(zhuǎn)移的這一通道，故與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。(2)ARTN可促進神經(jīng)侵襲，這個理論在既往文獻中有報道，而又有神學(xué)者提出經(jīng)侵襲可能是除腫瘤經(jīng)典轉(zhuǎn)移方式之外的新的轉(zhuǎn)移方式[20]，可能本次實驗中所取樣本患者鱗癌轉(zhuǎn)移方式除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移外，尚存在神經(jīng)侵襲方式，故與ARTN作用不全相符。(3)所取樣本距今時間較長，由于環(huán)境改變，不能全排除所取樣本患者發(fā)生遺傳物質(zhì)改變的可能。故ARTN在食管鱗癌中是否與神經(jīng)侵襲相關(guān)，神經(jīng)侵襲與患者臨床預(yù)后的關(guān)系將是我們下一步工作目標(biāo)。

綜上所述，本次研究證實了ARTN在從食管鱗癌癌前病變進展到食管鱗癌的過程中，表達量逐漸升高，且與患者腫瘤浸潤深度、臨床分期及預(yù)后相關(guān)，推測ARTN參與食管鱗癌的進展，可望成為監(jiān)測患者病情及判斷預(yù)后的新的生物學(xué)指標(biāo)。