劉春宏,邱國良,劉志斌,楊 毅,王麗華,李明章,張 茜

(1.四川大學 生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,四川 成都 610065; 2.四川省自然資源科學研究院,四川 成都610041)

1 引言

獼猴桃原產(chǎn)于中國,果肉中含有大量對人體健康重要的生物活性物質(zhì),是一種功能性很強的水果。經(jīng)常食用獼猴桃不僅能改善人體營養(yǎng)狀況,還能促進人體消化，增強免疫和代謝吸收[1]。經(jīng)過多年訓化和培育,目前全世界獼猴桃有76個品種、125個變種[2,3,4],但大部分為中華獼猴桃(A.chinensis)和美味獼猴桃(A.deliciosa)。我國是獼猴桃馴化品種的起源地和野生獼猴桃多樣性的中心,目前已成功培育出眾多具有優(yōu)良商品性的獼猴桃品種[5]。如中華系(“紅陽、紅什1號、武植3號、黃金果”等)、美味系(“和平1號、貴長、秦美、徐香、翠香”等)、軟棗系(“魁綠、恒優(yōu)1號、天源紅、寶貝星”等)和毛花系(“華特、贛獼6號”等)。隨著市場需求量擴大,獼猴桃的種植面積也日益增加,地區(qū)之間采粉、果實銷售等活動頻繁發(fā)生,加速了獼猴桃細菌性潰瘍病在不同種植區(qū)的肆虐,發(fā)病率逐年上升，特別是四川省的主栽品種“紅陽”獼猴桃感病率特別高[6]。獼猴桃潰瘍病的泛濫,使四川地區(qū)現(xiàn)有獼猴桃商品種的種植面臨著前所未有的挑戰(zhàn)。為了抵御獼猴桃病害的進一步侵襲,應優(yōu)化區(qū)域品種比例,栽種具有優(yōu)良抗病性及商品性的品種,并加強抗病性紅肉獼猴桃品種的選育。

野生軟棗獼猴桃分布廣,主要分布在西伯利亞東部、韓國、日本和我國長江以北的黑龍江和吉林等地區(qū)[7]，其果樹抗性強、感病率低、種植范圍小。在我國,商業(yè)性軟棗獼猴桃品種主要種植在我國東北、華北、西北和長江流域[8],具有良好的耐寒特性;在國外,美國東部、德國、中歐和俄羅斯是軟棗獼猴桃主要的種植區(qū),且在冬季氣溫降至-30℃條件下,軟棗獼猴桃每年仍能正常地收獲果實[9]。同時，軟棗獼猴桃的果皮易于食用,不必剝皮,果肉味道優(yōu)于成熟的草莓、香蕉、菠蘿、歐洲醋栗[10]。

軟棗獼猴桃“魁綠”是中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所成功選育出的新品種,具有上述優(yōu)良園藝性狀和商業(yè)價值。同時,在絕對低溫-38℃地區(qū)栽培,多年均無凍害和嚴重病蟲害發(fā)生，在凡無霜期120天以上、10℃以上有效積溫達到2500℃的地方均可栽培[11]。四川地區(qū)是我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū),種植面積和產(chǎn)量居全國第二位。但近幾年四川省的主要栽培品種“紅陽”獼猴桃(60%種植面積)受病害侵襲嚴重,時有毀園現(xiàn)象發(fā)生,嚴重阻礙了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究中的軟棗獼猴桃“魁綠”屬于四川獼猴桃種植區(qū)新引進品種,對優(yōu)化四川省獼猴桃品種比例具有重要意義，掌握“魁綠”果實的生長和營養(yǎng)成分變化規(guī)律意義重大,可為其果樹栽培管理提供有關(guān)數(shù)據(jù)依據(jù)。

獼猴桃果實風味受到幾種成分的影響,包括糖分(葡萄糖、果糖和蔗糖)、有機酸(檸檬酸、奎尼酸、蘋果酸和抗壞血酸)和揮發(fā)性芳香化合物,口感高度依賴于可溶性糖和非揮發(fā)性有機酸之間的平衡[12,13]。其他幾個商業(yè)獼猴桃種果實發(fā)育過程中糖和有機酸的變化規(guī)律在國內(nèi)外已有報道,如“Hayward、Hort16A、紅陽”等[14-16],而“魁綠”獼猴桃只有軟熟可食階段和風味相關(guān)的數(shù)據(jù),果實生長發(fā)育過程中理化性質(zhì)的變化鮮有報道。鑒于上述原因,我們以軟棗獼猴桃“魁綠”植株為樣本,定期(每15天)測定果實從盛花期(DAA)到生理成熟過程中糖分、有機酸和維生素C變化。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本實驗所采用的獼猴桃品種為“魁綠”,實驗在四川省自然資源科學研究院的紅白獼猴桃進行(104°16′N、31°13′E)。首先，選擇4株獼猴桃樹體生長狀況良好、樹齡一致、樹勢、朝向與結(jié)果水平相當?shù)墨J猴桃果樹;15DAA后開始從每棵獼猴桃樹樹冠的不同部位、不同方向隨機選取15—20個生長發(fā)育較為一致、無病蟲害、無損傷的果實進行定果和貼標簽處理,用于定期(15天)測量果實縱橫經(jīng)變化,直至果實達到采收期(120DAA)。用于理化性質(zhì)測量的獼猴桃果實也一樣,從30DAA開始采樣測定,每隔15天采樣一次,每次一個重復組取10顆果實,并做好標記,放入袋子,帶回實驗室后去除果皮,在低溫環(huán)境下(為減少不必要的化學反應)用榨汁機榨成果漿,用部分果漿進行實驗測定,剩余部分液氮快速冷凍,-70℃超低溫冰箱保存,以做進一步分析。

2.2 儀器設(shè)備

實驗用儀器設(shè)備主要包括：PL 4002-1C電子天平(METTLER TOLEDO)、JYL—C50T榨汁機(九陽股份有限公司)、PAL-1便攜式數(shù)顯折射計(ATAGO)、游標卡尺(中國)、SORVALL ST16R centrifuge冰凍高速離心機(Thermo Fisher)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏)、TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)、高效液相色譜儀(HPLC,CBM20A,Shimadzu,Tokyo,Japan)、超高液相色譜儀(UPLC,ACQ-ELSD)。

2.3 試劑

實驗用試劑包括：磷酸、磷酸二氫銨、蒽酮、氫氧化鈉等(均為國產(chǎn)分析純)，乙腈和甲醇(色譜級,Sangon Biotech)，糖(葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，Sangon Biotech)和有機酸(奎尼酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、莽草酸、琥珀酸、馬來酸、乳酸,BBI Life Science)。

2.4 方法

實驗采用電子天平稱量果實重量(g),游標卡尺用于測量果實縱橫經(jīng),PAL-1便攜式數(shù)顯折射計測定總可溶性固形物含量(%或Brix);可溶性糖、淀粉含量的測定參照Jin Gook Kim的方法[17];維生素C采用國標[18](GBT 5009.86-2003)的2,4-二硝基苯肼法;可滴定酸含量的測定參照曹建康的方法[19];糖分和有機酸的提取方法參照Maja和Mikulic的方法[20,21]。

糖測定條件:色譜柱(ACQUITY UPLC BEHTMAmide 2.1mm×100mm,1.7μm),儀器為超高液相色譜儀(Water ACQUITY UPLC),檢測器(ACQUITY-ELSD)。進樣量1μL,流動相0.2%乙腈:水。條件:前6min,初始濃度為100% MILLIPORE超純水以流速為0.26mL/min線性梯度洗脫至70%MILLIPORE超純水;6—16min,用100%ddh2O進行洗脫,柱溫40℃。

有機酸測定條件:島津LC-20A液相色譜儀,二極管陣列檢測器(CBM20A, Shimadzu,Tokyo,Japan);C18 柱(250×4.5nm),波長210nm,進樣量10μL,柱溫25℃;流動相為50Mmol/L磷酸二氫銨水溶液(pH2.5),流速0.3mL/min進行等度洗脫。

3 結(jié)果與分析

3.1 果實重量和縱橫經(jīng)的變化

根據(jù)相關(guān)研究,軟棗獼猴桃果實總可溶性固形物(TSS)含量達到8%為最適采收期[22]。軟棗獼猴桃果實從盛花期(DAA)到軟熟的時間約為120天,成熟時果重約為14.08g(圖1A)。軟棗獼猴桃“魁綠”果重的變化規(guī)律呈雙“S”曲線，在30DAA之前呈指數(shù)式增加,且在30DAA增加到6.7g,為最終果重的47.58%;30—90DAA之間,軟棗獼猴桃“魅綠”果重增長速率逐漸減緩,從6.7g增加到12.26g;在90—105DAA之間有第二次快速增加,達到14.58g;采收時(120DAA)軟棗獼猴桃“魅綠”的果重有輕微的降低。

注：誤差線代表標準差(n=10)。

圖1軟棗獼猴桃“魁綠”果實重量(A)，縱徑、大橫徑和小橫徑(B)從盛花期到果實成熟的生長規(guī)律

軟棗獼猴桃“魅綠”的果實的縱徑、大橫徑、小橫徑的增長模式為單“S”型曲線(圖1B)。軟棗獼猴桃“魅綠”的縱徑在0—30DAA之間快速增加,增長到25.45mm,每天增長量為0.526mm，后緩慢增加至25.45—36.75mm。軟棗獼猴桃“魅綠”的大橫徑和小橫徑也有類似的趨勢,在0—30DAA間呈指數(shù)式增加,后逐漸趨于平緩,各自的范圍為6.73—27.87mm、6.24—24.95 mm。果形指數(shù)是商品果實的質(zhì)量指標之一,商品果要求果形指數(shù)不低于0.93。軟棗獼猴桃“魁綠”果實的果形指數(shù)(縱徑/橫徑)在0—60DAA呈逐漸降低的趨勢,從1.44下降到1.29;后在60—120DAA之間,果形指數(shù)保持相對恒定(1.27—1.31)。因此,“魁綠”獼猴桃果實在整個發(fā)育過的果形指數(shù)>0.93,呈典型的長圓形,具有優(yōu)質(zhì)商品果的特性。

3.2 非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量變化

從圖2A實驗結(jié)果可見,“魁綠”獼猴桃干物質(zhì)(DM)積累方式較獨特,呈線性關(guān)系:y=0.2005x+0.0975,R2=0.9887(y=干物質(zhì)含量,x=取樣時間)。在0—45DAA之間,軟棗獼猴桃“魅綠”的DM含量急劇增加,平均每天增加0.224%;在45—120DAA間保持平穩(wěn)上升狀態(tài),DM含量從9.84%上升到25.14%。軟棗獼猴桃“魅綠”果實的總可溶性固形物(TSS)和DM的變化方式差異性較大。在30—75DAA之間，軟棗獼猴桃“魅綠”的TSS維持穩(wěn)定狀態(tài),含量范圍是3.62%—4.60%(Brix);從75DAA開始,TSS含量呈曲線上升,特別是在采收前兩周,即105—120DAA時間段內(nèi),TSS急劇上升,從9.47%增加到17.50%,平均每天增加0.535%。

注：誤差線代表標準差(n=3)，圖2—4同。

圖2果實發(fā)育過程中干物質(zhì)和總可溶性固形物(A)和總非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(B)的變化

從圖2B可見,軟棗獼猴桃“魅綠”的果實淀粉含量從60DAA后積累明顯增加,在90DAA達到最大濃度9.75g/100gFW,后開始加速下降,且淀粉的水解進一步加速了可溶性總糖和蔗糖的積累速率，如可溶性糖在90DAA之前保持平穩(wěn)上升;90—120DAA期間,隨著軟棗獼猴桃“魅綠”的淀粉水解,可溶性糖呈階段性增長,采收時(120DAA)可溶性總糖含量達到最高值10.50%。葡萄糖、果糖、蔗糖是軟棗獼猴桃“魁綠”果實發(fā)育過程中主要的可溶性糖組分。軟棗獼猴桃“魅綠”的蔗糖在發(fā)育早期階段有個短暫的平穩(wěn)過程(30—60DAA),后呈上升趨勢,最終達到5.34g/100gFW。軟棗獼猴桃“魅綠”的果糖、葡糖糖在在整個發(fā)育過程中,濃度幾乎相同,變化規(guī)律一致(呈線性增加),在75DAA后,蔗糖含量始終高于葡萄糖和果糖含量。在果實成熟時軟棗獼猴桃“魅綠”有少量麥芽糖生成,含量為1.34 g/100gFW。

圖3 果實發(fā)育過程中有機酸(奎寧酸、檸檬酸、蘋果酸) 濃度(A)和平均每個果實酸積累量(B)的動態(tài)變化

3.3 有機酸含量變化

在果實發(fā)育前期階段(90DAA之前),軟棗獼猴桃“魅綠”果實中含有少量的草酸、琥珀酸和馬來酸,后面隨著果實重量增加,三種酸含量逐漸下降。軟棗獼猴桃“魅綠”草酸濃度范圍0.5—5mg/gFW,琥珀酸和馬來酸濃度低于0.05mg/gFW。從圖3A可知,軟棗獼猴桃“魁綠”果實中的酸主要是奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸。在60DAA之前,軟棗獼猴桃“魅綠”果實中酸的積累以奎寧酸為主,酸的濃度都呈下降趨勢。在15—45DAA期間,軟棗獼猴桃“魅綠”蘋果酸和檸檬酸濃度保持相對穩(wěn)定;在45—105DAA期間,檸檬酸濃度快速上升(4.08—10.68mg/gFW),采收時下降到9.09mg/gFW。從45DAA開始,軟棗獼猴桃“魅綠”奎寧酸和蘋果酸濃度變化趨勢一樣,呈逐漸減低的過程。如果考慮果實的重量(圖3B)，在60DAA前,除了檸檬酸外,“魁綠”平均每個果實中奎尼酸和蘋果酸的積累與濃度變化趨勢具有差異性,如奎寧酸在15—60 DAA時含量保持相對穩(wěn)定(75.11—82.93mg/fruit),蘋果酸在45DAA時達到最大值,含量為54.92mg/fruit。60DAA到采收前,軟棗獼猴桃“魅綠”果實平均含量與濃度變化趨勢一致,總體上均呈下降的趨勢,采收時平均每個果實中奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸的含量各為42.42mg/fruit、128.07mg/fruit、18.07mg/fruit。

3.4 抗壞血酸(VC)濃度的變化

軟棗獼猴桃“魅綠”VC的濃度范圍在112.79—235.87mg/100gFW之間(圖4)。在30—45DAA期間,軟棗獼猴桃“魅綠”VC變化與有機酸濃度變化趨勢基本一致,從180.93mg/100gFW上升至235.87mg/100gFW;45—90DAA，劇烈下降到130.99mg/100gFW;90—120DAA,含量變化不大,呈緩慢降低的趨勢。軟棗獼猴桃“魅綠”果實成熟采收時濃度達到最低,為112.79mg/100gFW。

圖4 軟棗獼猴桃“魅綠”果實發(fā)育過程中VC含量的變化

4 討論

軟棗獼猴桃“魁綠”果實重量變化成雙“S”曲線(圖1A),最終平均果重為14.08±1.87g,增加速度表現(xiàn)為“快—慢—快—慢”的節(jié)奏；同時，從圖2A可見，“魁綠”果實DM積累所表現(xiàn)出的規(guī)律與果實鮮重增加的規(guī)律相似,幾乎為同步變化。這與樸一龍[23]、魏麗紅[24]等在“長白山野生軟棗”和軟棗獼猴桃“恒優(yōu)1號”上的研究成果相類似。另外，2012年Jin Gook Kim等[17]對日本地區(qū)的軟棗獼猴桃“Mitsuko”研究表明,獼猴桃果重在盛花期(DAFB)50天之前迅速增加,然后增加速率逐漸變緩;在80—95DAFB之間第二次快速增加,呈典型的雙“S”增長曲線。這些相似結(jié)果充分說明軟棗獼猴桃“魁綠”適合引種并栽培在四川地區(qū),可成為現(xiàn)有易感病商業(yè)獼猴桃種的替代種。然而,也有一些文獻報道美味獼猴桃“海沃德”和中華獼猴桃“Hort16A、紅陽”果實果重發(fā)育呈單“S”增長曲線[14-16]，這些差異性可能是由品種間差異性造成的。

從圖1B可見,軟棗獼猴桃“魅綠”果實的縱徑、大橫徑和小橫徑變化規(guī)律呈簡單的“S”型增長曲線,可劃分為兩個生長階段:快速生長期(0—30DAA)和緩慢生長期(30—120 DAA)。在快速發(fā)育階段,軟棗獼猴桃“魅綠”果實的縱徑、大橫徑和小橫徑在30DAA時分別達到25.45 mm、19.32mm、18.32mm,生長量分別為果實軟熟時的69.25%、69.32%、67.97%,這一時期是果實生長高峰期;緩慢生長期,軟棗獼猴桃“魅綠”的果實縱橫徑生長速率僅為0.126mm/d、0.092mm/d、0.089mm/d?！翱G”果實的縱橫徑生長變化與Richardson[14]、金方倫[25]、Walton[26]等對中華獼猴桃“Hort16A、貴長、美味獼猴桃海沃德”的研究一致,都呈“S”型增長曲線。

可溶性糖和淀粉是獼猴桃果實DM的主要成分,含量約占DM含量的75%[27]。因此,DM可表示獼猴桃果實中潛在含糖量,是獼猴桃的另一個有用的風味指標[28]。從圖2A可見,軟棗獼猴桃“魅綠”的DM呈線性增加(y=0.2005x+0.0975,R2=0.9887),采收時含量為25.14%。獼猴桃果實的總可溶性固形物(TSS)是田間采收的重要指標,目前國內(nèi)普遍認為獼猴桃果實總可溶性固形物含量最低采收標準不得低于6.5%,不得高于10%[29-31]。根據(jù)本研究結(jié)果,軟棗獼猴桃“魅綠”的果實在90DAA時,TSS的含量為6.33%；在105DAA時，TSS含量為9.47%,最適采收期為95—105DAA。

獼猴桃果實中的糖分(圖2B)主要是果糖、葡萄糖、蔗糖,有機酸(圖3A)以奎寧酸、檸檬酸、蘋果酸、VC為主。通過綜合分析軟棗獼猴桃“魅綠”的果實發(fā)育(果重和縱橫徑變化規(guī)律)和營養(yǎng)代謝規(guī)律(可溶性糖及有機酸的動態(tài)變化),可把果實的發(fā)育可分為三個階段:果實快速生長期(0—60DAA)、淀粉積累(60—90DAA)和果實成熟期(90—120DAA)。這與Moscatello[32]、Richardson[14]等的研究結(jié)果相似。

軟棗獼猴桃“魅綠”的果實快速生長期約60天,這一時期是果樹掛果后果實快速膨大、縱徑和橫徑(大橫徑和小橫徑)增長的關(guān)鍵期。此時期獼猴桃的有機酸含量較高,并以奎寧酸為主;VC含量在45DAA時達到最大值235.79mg/100gFW,蘋果酸和檸檬酸在30—45DAA期間,濃度保持恒定,這時期的特征與Nardozza等[33]的研究一致。

軟棗獼猴桃“魅綠”的淀粉積累期時間約為30天(60—90DAA)，這一時期以淀粉的快速積累為主,其淀粉含量從4.81g/100gFW增加到9.75g/100gFW。其他特點是:軟棗獼猴桃“魅綠”的果實葡萄糖、果糖和蔗糖含量變化平緩,而總可溶性糖從3.24g/100gFW呈線性增加到4.74g/100gFW;蘋果酸含量快速地從4.06mg/gFW下降到1.79mg/gFW;奎寧酸先從7.71mg/gFW急劇降到3.89mg/gFW后保持相對穩(wěn)定;VC含量降低速率逐漸加快,在90DAA為130.99mg/100gFW;而檸檬酸含量逐漸加速上升,至90DAA含量達到9.01mggFW;總酸度在90DAA時達到最大值1.84%。軟棗獼猴桃“魁綠”這一時期的可溶性糖和有機酸的變化趨勢與“Hayward、Hort16A”相同[14,15],但有機酸含量在整個淀粉積累期低于其他商業(yè)種。

軟棗獼猴桃“魅綠”的果實成熟期約為30天(90—120DAA),這一時期是果實品質(zhì)形成的關(guān)鍵階段，特點是:淀粉加速分解轉(zhuǎn)變?yōu)檎崽?、果糖和葡萄糖積累量低,速率慢,采收時量各為5.34g/100gFW、2.45g/100gFW、2.73g/100gFW。軟棗獼猴桃“魅綠”的總糖含量為11.25%,比種植在東北地區(qū)含量高2.45%,比“寶貝星”高2.4%,與軟棗獼猴桃“佳綠、優(yōu)系8401”含量幾乎相同[34]。軟棗獼猴桃“魅綠”的檸檬酸在105DAA達到最大值10.68mg/gFW,軟棗獼猴桃“魅綠”采收時下降到9.09mg/gFW,而總酸度、奎寧酸、蘋果酸及VC含量緩慢降低,采收時濃度分別為1.49%、3.08mg/gFW、1.28mg/gFW、112.79mg/100gFW。采收時果實營養(yǎng)品質(zhì)與樸一龍[23]、魏麗紅[24]等研究結(jié)果相似。因此,四川地區(qū)適合引種栽培軟棗獼猴桃“魅綠”。

綜上所述,軟棗獼猴桃“魅綠”成熟時營養(yǎng)品質(zhì)好,營養(yǎng)成分含量與其他商業(yè)品種類似,具有優(yōu)良商品性,適合在四川地區(qū)引種栽培，可以優(yōu)化區(qū)域品種比例。但在栽培過程中應注意以下幾點:①軟棗獼猴桃“魅綠”果樹屬于中等喜光性果樹樹種,喜散射光照射。應選擇溫暖濕潤,陽光強度為40%—45%,土壤肥沃且偏中性或微酸性,不積水,耐干旱的向陽緩坡栽培。②軟棗獼猴桃“魅綠”果實生長周期短,僅為120DAA。8月下旬是軟棗獼猴桃“魅綠”果實成熟期,采果后9月上旬應及時施用基肥,如漚肥、餅肥、家禽糞便等。③及時追肥。軟棗獼猴桃“魅綠”果樹開花早,4月中旬為盛花期,應在4月初施用開花坐果肥;果實膨大期短,僅為30天,5月上旬及時施用果實膨大肥,以速效鉀肥為主,加施氮肥;果實成熟前6—7周,即7月中旬施用果實增質(zhì)肥。