王雪青，蔣榮霞，郭志鵬，連喜軍，郭俊杰

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藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生機(jī)理研究

王雪青，蔣榮霞，郭志鵬，連喜軍※，郭俊杰

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

藻藍(lán)蛋白是螺旋藻中對(duì)人體具有多種保健功能的蛋白，初步發(fā)現(xiàn)其具有明顯促進(jìn)玉米淀粉回生的作用。為了進(jìn)一步探索其促進(jìn)玉米淀粉回生的機(jī)理，該文將1%和10%藻藍(lán)蛋白及其水解物添加至玉米直鏈、支鏈及其混合淀粉中，測(cè)定其對(duì)淀粉回生的影響，通過(guò)X-射線衍射、差示掃描量熱、紅外和固體核磁分析藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米淀粉回生機(jī)理。研究結(jié)果表明，添加1.0%藻藍(lán)蛋白對(duì)直鏈淀粉回生率沒(méi)有影響，使支鏈淀粉回生率提高了61.4%；而添加量為10%的藻藍(lán)蛋白使直鏈淀粉回生率提高了60.4%，使支鏈淀粉回生率提高了69.6%。藻藍(lán)蛋白水解肽低的添加量（1.0%）對(duì)玉米直鏈的回生率影響不顯著，但使支鏈淀粉的回生提高了28.1%；水解肽高添加量（10.0%）使玉米直鏈淀粉的回生率提高了184.7%，使玉米支鏈淀粉的回生率提高了47.0%。紫外可見(jiàn)掃描顯示堿性蛋白酶水解可使處于藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)中心的藻藍(lán)素外露出來(lái)。X射線結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白與玉米直鏈支鏈淀粉混合回生后分別產(chǎn)生一個(gè)衍射角為2為16.44o 、16.60o尖銳衍射峰。差熱結(jié)果顯示，藻藍(lán)蛋白與玉米支鏈淀粉混合、藻藍(lán)蛋白水解物與玉米直鏈淀粉混合后，所得回生淀粉均失去結(jié)晶峰，而出現(xiàn)唯一重結(jié)晶峰。紅外和13C固體核磁結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白通過(guò)精氨酸氨基與玉米支鏈淀粉還原端醛基形成氫鍵，利用藻藍(lán)蛋白中疏水性氨基酸驅(qū)離玉米支鏈淀粉側(cè)鏈末端水分子，促使支鏈淀粉末端雙螺旋解旋，加快了支鏈淀粉末端鏈間氫鍵形成，提高了其回生率；而藻藍(lán)蛋白水解物中半胱氨酸巰基和玉米直鏈淀粉還原端醛基在與直鏈淀粉混合回生過(guò)程形成氫鍵，通過(guò)分子甩動(dòng)使直鏈淀粉雙螺旋解開，大大促進(jìn)了玉米直鏈淀粉間形成氫鍵，提高了其回生率。該研究提供了一種提高玉米淀粉回生率的新技術(shù)。

農(nóng)產(chǎn)品；淀粉；水解；回生淀粉；藻藍(lán)蛋白；回生機(jī)理

0 引 言

作為一種膳食纖維，回生抗性淀粉具有通便、控制體質(zhì)量、輔助控制糖尿病、通過(guò)促進(jìn)盲腸乳酸菌繁殖來(lái)提高人體免疫力等功效[1]。但低的產(chǎn)率是限制其產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。為了提高回生淀粉制備率，國(guó)內(nèi)外研究人員在淀粉乳濃度、貯藏溫度和時(shí)間、干燥和擠壓工藝、微波、超聲波處理、酶處理、添加生物大分子有機(jī)物等方面做了大量的研究。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和10%的蕎麥淀粉乳在0 ℃貯藏回生率較高，達(dá)到30.0%以上，而5%、15%和20%濃度下2和6 ℃下貯藏淀粉回生率高[2]。在-18 ℃下冷凍貯藏條件下，糯米淀粉濃度由1%增加到25%，冷凍1 d糯米淀粉的最低回生率由4.5%增加到15.7%；10%～15%的糯米淀粉乳在此條件下貯藏7 d，糯米淀粉的回生率會(huì)大于40.0%[3]。在真空干燥溫度30 ℃，真空度0.08 MPa時(shí)，老化98 h，甘薯淀粉回生率達(dá)到20.9%[4]。擠壓處理及次數(shù)也能影響回生率，重復(fù)擠壓處理可以使玉米淀粉回生率提高到40%以上[5]，3次重復(fù)回生和高低溫循環(huán)老化也能明顯促進(jìn)淀粉的回生[6-7]。超聲波處理可以使甘薯淀粉的回生率提高2.28倍[8]，而電解和微波聯(lián)合處理可以使甘薯淀粉的回生率提高1倍[9]。普魯蘭酶和高壓濕熱處理可以使黑豆淀粉回生率提高到41.3%[10]，而中溫α-淀粉酶處理可以將甘薯淀粉的回生率提高1.68倍[11]。由于普魯蘭酶和淀粉酶使淀粉側(cè)鏈斷裂而產(chǎn)生更多的直鏈淀粉，從而增加淀粉回生淀粉的成核與結(jié)晶速率[12]。根據(jù)晶體形成理論，添加晶種也能增加回生淀粉的生成，課題組曾經(jīng)采用草酸侵蝕馬鈴薯回生淀粉制備晶種促進(jìn)玉米淀粉的回生，使得玉米淀粉的回生率由7.37%提高至11.46%[13]。雖然上述的物理方法和化學(xué)酶法可以在一定程度上提高回生淀粉的制備率，但未超過(guò)45%，規(guī)?；a(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)。因此，尋找更有效快捷的提高淀粉回生率方法及相關(guān)機(jī)制的研究一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，一些有機(jī)大分子多糖和蛋白通過(guò)添加至淀粉中與其共回生，可以對(duì)回生率有顯著的影響。Luo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加淀粉量5%～7.5%菊糖會(huì)促進(jìn)玉米支鏈淀粉回生，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)[15]，添加醇溶蛋白可使玉米淀粉的回生率由9.4%增加到29.3%。最近課題組進(jìn)一步通過(guò)分析核磁、紅外等提出了這種含有醇溶蛋白回生淀粉的一種可能結(jié)構(gòu)[16]。為了尋找能更加有效提高淀粉回生率的有機(jī)大分子，課題組嘗試?yán)迷逅{(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米淀粉回生，發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白及其水解物均可促進(jìn)玉米直支鏈淀粉的回生，添加淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為10.0%的藻藍(lán)蛋白水解物可以使玉米直鏈淀粉的回生率提高到50%以上。通過(guò)固體核磁和紅外分析，提出了藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生的可能 機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉、螺旋藻（程海湖牌）為市售；PBS（phosphate buffer saline）磷酸鹽緩沖液購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司、NaCl、NaOH、(NH4)2SO4、BaCl2和CH3CH2OH購(gòu)自天津鑫橋化工貿(mào)易有限公司；高溫淀粉酶、脂肪酶、堿性蛋白酶由天津市諾奧科技發(fā)展有限公司提供。

YXQG02手提式電熱壓力蒸汽消毒器，山東安德醫(yī)療科技有限公司；DH-101-3BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；BCD-229KB海爾冰箱，青島海爾股份有限公司；L535-1離心沉淀機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Bio-Rad FES135紅外分光光度計(jì)，美國(guó)Bio-Rad公司；島津UV-2450/2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；DSC204C 型差示掃描量熱分析儀（德國(guó)Netzach 公司）；D8 ADV ANCE型X 射線衍射儀(德國(guó)Bruker AX S公司)；Varian Unity 300 MHz 核磁共振譜儀（美國(guó)Varian公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白的提取

藻藍(lán)蛋白的提取參照課題組前期的試驗(yàn)方法[17]。1）細(xì)胞破碎：取400 g螺旋藻粉溶于4 000 mL的10 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（0.01 mmol/L pH值為6.8 PBS緩沖液）中浸泡4 h，于-20～4 ℃之間反復(fù)凍融4次，每次融化后用超聲波輔助破碎，功率400 W超聲6 s間隔15 s，超聲次數(shù)60次。然后在轉(zhuǎn)速10 000 r/min、溫度4 ℃條件下下冷凍離心30 min，棄沉淀取上清液。2）鹽析：離心后的藍(lán)色上清液樣品，在4 ℃條件下緩慢加入(NH4)2SO4直至濃度為28%飽和，繼續(xù)攪拌使(NH4)2SO4充分溶解，4 ℃靜置過(guò)夜。而后在10 000 r/min，4 ℃下冷凍離心30 min除去少量雜蛋白，收集上清液。其上清液再由濃度為55%飽和硫酸銨沉淀，4 ℃下靜置4 h后以10 000 r/min離心30 min，收集藍(lán)色蛋白沉淀。3）透析：用PBS溶液收集鹽析所得沉淀，裝入透析袋中透析除去(NH4)2SO4鹽（截留分子量8～14 kD）。將裝有樣品的透析袋置于0.01 mol/L pH值為6.8的PBS緩沖液中透析，多次更換緩沖液，用BaCl2檢測(cè)無(wú)沉淀即為透析終點(diǎn)。透析后，所得樣品可用聚乙二醇進(jìn)行濃縮，冷凍干燥后4 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)凍干的藻藍(lán)蛋白經(jīng)過(guò)適量稀釋后，分別測(cè)定其波長(zhǎng)為620和280 nm的吸光度值，以吸光度620/280比值來(lái)表示純度，經(jīng)此法制備的藻藍(lán)蛋白純度為1.35。

1.2.2 藻藍(lán)蛋白酶水解

將純化后的藻藍(lán)蛋白用堿性蛋白酶水解制備藻藍(lán)蛋白水解物，堿性蛋白酶水解條件：蛋白液pH值為8.0、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間60 min加酶量為蛋白質(zhì)質(zhì)量的0.1%。酶解完的水解液冷凍干燥后備用。

1.2.3 玉米直支鏈淀粉制備

依照課題組方法制備的玉米直支鏈淀粉[18]。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～15%的玉米淀粉用水分散后，于95 ℃水浴鍋中攪拌糊化2 h至透明，120 ℃進(jìn)一步高壓（0.2 MPa）糊化40 min。冷卻至常溫后放冰箱中4 ℃老化2 d，每100 mL淀粉乳中加入0.6 mL高溫淀粉酶酶解，離心得到沉淀水洗后得到回生淀粉。將得到的回生淀粉用4 mmol/L KOH溶解后加入3倍體積的正丁醇，充分?jǐn)嚢韬箅x心分離得到沉淀即為玉米直鏈淀粉。上清液中加入1倍體積乙醇得到沉淀即為玉米支鏈淀粉。得到的玉米直支鏈淀粉再按照文獻(xiàn)[19]的方法除去脂肪和蛋白，水洗后成為純化后玉米直支鏈淀粉。進(jìn)行回生試驗(yàn)的玉米直支鏈淀粉不進(jìn)行干燥，以濕淀粉形式保存于4 ℃冰箱，取10 g濕淀粉干燥后得到淀粉干濕比例。

1.2.4 玉米直、支鏈淀粉與藻藍(lán)蛋白及其水解物的共同回生

取相當(dāng)于干淀粉10 g的玉米直鏈、支鏈濕淀粉，按照干燥淀粉質(zhì)量比例的1.0%、10.0%分別將藻藍(lán)蛋白及其水解物與玉米直鏈和支鏈淀粉（濕的狀態(tài)）進(jìn)行混合，加入20 mL 蒸餾水，95 ℃手動(dòng)攪拌、糊化1.5 h，進(jìn)一步高溫高壓（0.1 MPa，121 ℃）糊化30 min，冷卻后于4 ℃冰箱老化48 h。之后采用文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定回生率。

1.2.5 測(cè)試方法

探索藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生機(jī)制測(cè)定紫外可見(jiàn)吸收、紅外、固體核磁、X射線衍射時(shí)，藻藍(lán)蛋白采用純品（西安明朗生物科技有限公司純度98%），添加量為淀粉量的30%。藻藍(lán)蛋白及其水解物的紫外可見(jiàn)吸收測(cè)定：將藻藍(lán)蛋白及其水解物用著蒸餾水稀釋后靜置30 min，用島津UV-2450/2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)；X射線衍射分析：將粉末狀樣品放入D8 ADV ANCE型X射線衍射儀（德國(guó)Bruker AX S公司），采用Cu靶KT射線（0.154 nm）照射，管壓為40 kV，管流為40 mA，掃描速度為0.1 (°)/s。紅外分析：將樣品用光譜純KBr壓片，在27 ℃下用紅外分光光度計(jì)Bio-Rad FES135測(cè)定淀粉紅外吸收，掃描范圍4 000～400 cm-1；固體核磁分析：將蛋白或淀粉樣品置于密封的 PENCIL型（5-mm）氧化鋯轉(zhuǎn)子中，在Varian Unity 300 MHz核磁共振譜儀上進(jìn)行，共振頻率為75 kHz，對(duì)應(yīng)90°脈沖寬度為3.4s，使用4 mm的雙共振HX CP/MAS（交叉極化/魔角旋轉(zhuǎn)）探頭，魔角旋轉(zhuǎn)（MAS）的速度由轉(zhuǎn)速控制柜自動(dòng)控制在9～12 kHz，試驗(yàn)溫度范圍是28～120 ℃。差示掃描量熱分析：采用DSC204C型差示掃描量熱分析儀（德國(guó)Netzach公司）進(jìn)行分析測(cè)試，升溫速率為0.02 ℃/s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

變量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±），表示，采用檢驗(yàn)。采用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白及其水解物對(duì)玉米直支鏈淀粉回生的影響

表1為藻藍(lán)蛋白及其水解物對(duì)玉米直支鏈淀粉回生率的影響數(shù)據(jù)。由表1可知，添加1.0%藻藍(lán)蛋白對(duì)直鏈淀粉回生率沒(méi)有影響，而10%的添加量，則表現(xiàn)出有較顯著的促進(jìn)作用，使回生率從對(duì)照的27.0%提高至43.3%，提高了60.4%, 支鏈淀粉提高了69.6%；添加1%藻藍(lán)蛋白對(duì)支鏈淀粉產(chǎn)生明顯的促進(jìn)回生作用，回生率由26.7%增至43.1%，提高了61.4%，而當(dāng)添加量從1%增至到10%，支鏈淀粉回生率再增加效果不顯著，僅從43.1%提高到45.3%，提高了5.1%。對(duì)于藻藍(lán)蛋白水解肽來(lái)說(shuō)，低的添加量（1.0%）對(duì)玉米直鏈的回生率影響不顯著，但對(duì)支鏈淀粉的回生顯示出促進(jìn)作用（提高了28.1%），高添加量（10.0%）顯示出極強(qiáng)的促進(jìn)玉米直鏈淀粉的作用，回生率從27.0%增加到76.9%，增加了184.7%，而玉米支鏈淀粉的回生率從26.7%增加到39.2%，僅增加了47%。

因此，對(duì)于玉米直鏈淀粉，隨著藻藍(lán)蛋白或水解肽的添加量增加，促進(jìn)回生率也隨之增加。但是對(duì)于玉米支鏈淀粉僅是低的添加量，就顯示出其有效的促進(jìn)作用，再通過(guò)增大添加比例來(lái)增加回生率，效果不顯著。這可能是由于玉米直支鏈淀粉與藻藍(lán)蛋白或肽形成的氫鍵部位不同影響的結(jié)果。

表1 藻藍(lán)蛋白及其水解物對(duì)玉米直支鏈淀粉回生率的影響

注：* 為<0.05, ** 為<0.01。

Note: * means<0.05, ** means<0.01.

2.2 紫外可見(jiàn)掃描最大吸收分析

圖1為藻藍(lán)蛋白及其水解物的紫外可見(jiàn)最大吸收光譜圖。由圖1可知，藻藍(lán)蛋白的紫外可見(jiàn)最大吸收波長(zhǎng)為258.0、616.0 nm，無(wú)374 和 340 nm附近的藻膽素特征吸收峰，這與文獻(xiàn)報(bào)道相似[20-21]。藻藍(lán)蛋白水解物的紫外可見(jiàn)最大吸收波長(zhǎng)為258.0、346.0、613.5 nm，出現(xiàn)了藻膽素的特征吸收，說(shuō)明堿性蛋白酶水解使處于藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)中心的藻藍(lán)素外露出來(lái)。

圖1 不同濃度藻藍(lán)蛋白及其水解物紫外可見(jiàn)掃描光譜圖

2.3 X射線衍射分析

圖2為玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉的X射線衍射圖。由圖2a可知，試驗(yàn)采用的藻藍(lán)蛋白并非單個(gè)晶體，2衍射角為9.52°、21.34°、31.52°、45.22°，這與文獻(xiàn)報(bào)道葛仙米中藻藍(lán)蛋白的非晶體衍射（2衍射角為16.66°、20.68°、23.70°、29.06°、30.12°、33.66°、37.90°、40.32°、57.54°）不同[22]。由圖2b可知，藻藍(lán)蛋白水解后晶體2衍射角缺失31.52°和45.22°的2個(gè)晶面，而增加了2衍射角為8.78°的1個(gè)晶面。即晶體面間距小的晶面減少了而面間距比較大晶面增多了。由圖2c、2d可知，回生玉米直鏈淀粉衍射角2為16.76°、22.16°，回生玉米淀粉中支鏈淀粉衍射角2為17.22°、19.28°，這與課題組前期研究基本一致[23]。由圖2e可知，玉米直鏈淀粉與藻藍(lán)蛋白混合回生后，衍射角2為22.16°的尖銳峰消失，增加了衍射角2為19.36°、23.52°的衍射峰，但這2個(gè)峰周圍有許多衍生峰，峰型不尖銳。由圖2f可知，玉米直鏈淀粉和藻藍(lán)蛋白水解物混合回生后衍射角2為16.44°的峰明顯變得更加尖銳，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白水解物可加速玉米直鏈回生淀粉在此晶面上的聚集，從而大大加速了其回生的速度。由圖2 g可知，玉米支鏈淀粉和藻藍(lán)蛋白混合回生后衍射角2為16.60°的峰明顯變得更加尖銳，顯示藻藍(lán)蛋白可加速玉米支鏈回生淀粉在此晶面上的聚集，加速晶面形成。根據(jù)促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生樣品（2f、2g）尖銳衍射角減小可知，兩種物質(zhì)分別促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生機(jī)理可能跟它們加入后2衍射角為16.4°～16.7°的面間距增大有關(guān)。圖2e和2h中藻藍(lán)蛋白與直鏈淀粉、藻藍(lán)蛋白水解物與支鏈混合回生后淀粉的回生率增加不多，其2衍射峰也未出現(xiàn)明顯的尖銳峰，這也進(jìn)一步說(shuō)明尖銳衍射峰的出現(xiàn)和淀粉回生率提高有相關(guān)性。

2.4 差示掃描量熱分析

圖3玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉差示掃描量熱圖（differential scanning calorimeter, DSC）。由圖3可知，藻藍(lán)蛋白有2個(gè)晶體融化峰（134.40、140.69 ℃）（圖3a），藻藍(lán)蛋白水解物有1個(gè)主峰（112.86 ℃）和3個(gè)小峰。玉米直鏈回生淀粉有3個(gè)晶體融化峰（89.61、95.48、109.74 ℃），玉米支鏈回生淀粉有2個(gè)晶體融化峰（108.97、143.14 ℃）。這些晶體融化溫度均低于甘薯直支鏈回生淀粉[24]，這可能與玉米直支鏈淀粉平均鏈長(zhǎng)比甘薯直支鏈淀粉的短有關(guān)?；厣矸劬w中低溫為晶體融化溫度，高溫為淀粉重結(jié)晶融化溫度[25]。由圖3a、3c、3d、3e和3g可知，藻藍(lán)蛋白添加入玉米直支鏈淀粉后，其所得直鏈回生淀粉融化溫度由109.74升高到126.93 ℃，所得支鏈回生淀粉融化溫度由143.14降低到139.74 ℃，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白參與了玉米直支鏈的回生，參與回生的藻藍(lán)蛋白分子鏈長(zhǎng)介于玉米直鏈和支鏈淀粉之間。值得注意的是：藻藍(lán)蛋白與玉米支鏈淀粉混合回生后只有淀粉重結(jié)晶峰，而沒(méi)有晶體峰，此峰溫度與藻藍(lán)蛋白重結(jié)晶峰接近。說(shuō)明玉米支鏈淀粉中分子鏈長(zhǎng)與藻藍(lán)蛋白接近的分子數(shù)量多，這些分子之間更容易形成氫鍵，從而產(chǎn)生一種全新的含藻藍(lán)蛋白的回生功能淀粉。由圖3b、3c、3d、3f和3h可知，藻藍(lán)蛋白水解物添加入玉米直支鏈淀粉后，其所得直鏈回生淀粉融化溫度由109.74升高到118.37 ℃，所得支鏈回生淀粉融化溫度由143.14降低到130.02 ℃。與藻藍(lán)蛋白促進(jìn)玉米支鏈淀粉結(jié)果類似，藻藍(lán)蛋白水解物促進(jìn)玉米直鏈淀粉回生的差示掃描量熱圖（DSC）（圖3f）中，直鏈回生淀粉的晶體融化峰消失，只出現(xiàn)重結(jié)晶峰118.37 ℃，這個(gè)融化溫度與藻藍(lán)蛋白水解物的重結(jié)晶融化峰接近。其他2個(gè)低溫峰應(yīng)該是藻藍(lán)蛋白水解物不同分子晶體峰，與直鏈淀粉無(wú)關(guān)。從差熱融化溫度可知，藻藍(lán)蛋白及其水解物分別促進(jìn)玉米支鏈和直鏈淀粉回生，是因?yàn)檫@種結(jié)合能夠解開玉米直支鏈淀粉雙螺旋，為玉米直支鏈淀粉間形成氫鍵創(chuàng)造便利條件，進(jìn)而加速淀粉大分子晶體形成速度，大幅提高淀粉的回生率。

圖3 玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉差示掃描量熱圖

2.5 紅外光譜分析

圖4為玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉的紅外光譜圖。3 282～3 315 cm-1附近處的吸收峰為淀粉分子的O-H的伸縮振動(dòng)或者蛋白分子的N-H伸縮振動(dòng)，2 930 cm-1附近較尖銳峰是淀粉或蛋白亞甲基的C-H鍵的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，圖4 e、4f、4g、4h中1 644.1 cm-1處的吸收峰是淀粉中水的H-O-H的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 006.7 cm-1處為淀粉結(jié)構(gòu)C-O-C中C-O的振動(dòng)吸收峰[26-27]。圖4 a、4b中1 651.2 cm-1處為藻藍(lán)蛋白水解物中蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ鍵C=O的伸縮振動(dòng)[20]。圖4a、4b中1 408.8、1 411.6 cm-1為甲基的C-H剪式彎曲振動(dòng)，993～1 003 cm-1為C-O-H彎曲振動(dòng)[28]，前者峰強(qiáng)變?nèi)跽f(shuō)明藻藍(lán)蛋白水解物中肽鏈變短，藻藍(lán)蛋白中參與氫鍵的甲基被解離，后者峰強(qiáng)度減小變化可能與含羥基氨基酸與多糖連接被打斷有關(guān)。圖4 a、4b中1 538～1 550 cm-1處波數(shù)代表的酰胺Ⅱ鍵C-N伸縮振動(dòng)和N-H變形振動(dòng)的組合[28]，藻藍(lán)蛋白水解后該處峰強(qiáng)度減小，這是蛋白酶水解過(guò)程酰胺鍵斷裂所致。圖4e、4g中藻藍(lán)蛋白與玉米直支鏈淀粉混合回生后，玉米回生直鏈淀粉波數(shù)由3 285.3轉(zhuǎn)變?yōu)? 268.2 cm-1，支鏈淀粉由3 315.3轉(zhuǎn)變?yōu)? 282.5 cm-1，此處紅外波數(shù)的減小代表氫鍵的形成[28]，支鏈淀粉此處波數(shù)降低更多可能跟藻藍(lán)蛋白中的巰基、支鏈淀粉的還原端醛基參與了氫鍵的形成有關(guān)。此兩圖中可以觀察到酰胺Ⅰ、Ⅱ鍵的吸收峰，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白中羰基和氨基沒(méi)有參與淀粉回生過(guò)程氫鍵的形成。圖4f、4h中藻藍(lán)蛋白水解物與玉米直支鏈淀粉混合回生后，玉米回生直鏈淀粉波數(shù)由3 285.3轉(zhuǎn)變?yōu)? 282.5 cm-1，支鏈淀粉由3 315.3轉(zhuǎn)變?yōu)? 288.5 cm-1。根據(jù)表1結(jié)果可知，藻藍(lán)蛋白水解物促進(jìn)玉米直鏈淀粉回生非常明顯，而3 285.0 cm-1附近的紅外波數(shù)卻變化不大，說(shuō)明促進(jìn)回生的動(dòng)力來(lái)源于非羥基基團(tuán)如氨基或巰基。圖4f（黑色箭頭）中對(duì)應(yīng)于酰胺Ⅰ、Ⅱ鍵的紅外峰的消失正好印證了這種推測(cè)，這些羰基和氨基參與了氫鍵的形成，C=O、C-N伸縮振動(dòng)消失了?？偨Y(jié)紅外分析，藻藍(lán)蛋白促進(jìn)玉米支鏈淀粉的原因可能是藻藍(lán)蛋白中的巰基與支鏈淀粉還原端醛基之間形成了氫鍵；藻藍(lán)蛋白水解物促進(jìn)玉米直鏈淀粉回生可能是水解多肽的羰基、氨基與直鏈淀粉的羥基形成了氫鍵導(dǎo)致。

圖4 玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉的紅外光譜圖

2.6 13C固體核磁分析

圖5為玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉的13C固體核磁圖譜。根據(jù)文獻(xiàn)[29]，藻藍(lán)蛋白中含有的氨基酸主要有Arg、Asp、Ala、Cys、His、Thr、Glu、Leu、Ser、Val、Pro、Ile、Trp、Phe、Lys、Tyr、Met和Gly，圖5 a、5 b中化學(xué)位移176.7、176.6 ppm代表酰胺鍵，156.9 ppm代表Arg，129.6、128.5 ppm代表Phe，115.6 ppm可能是Tyr C3或His C4的化學(xué)位移[30-33]，但Tyr的139 ppm附近的峰強(qiáng)度很弱，說(shuō)明該氨基酸含量比較少，所以該處化學(xué)位移只能由His產(chǎn)生。蛋白酶水解藻藍(lán)蛋白后，此峰裂解為118.1和114.8 ppm，說(shuō)明水解過(guò)程蛋白的酰胺鍵在His連接位置斷開。圖5 a、5 b中92.9、93.7 ppm處化學(xué)位移為多糖C1原子，73.0、72.7 ppm處化學(xué)位移為多糖C2-5原子，60.6、60.8 ppm處化學(xué)位移為C6原子[34]。藻藍(lán)蛋白水解后多糖峰強(qiáng)度略有增強(qiáng)（60.8 ppm處C6原子峰的變化最明顯），說(shuō)明藻藍(lán)蛋白可能與藻多糖結(jié)合，蛋白酶水解過(guò)程使蛋白中氨基酸與多糖的C6連接打斷，更多多糖的C6顯示出化學(xué)位移。圖5 a、5 b中未出現(xiàn)代表Glu的折疊結(jié)構(gòu)化學(xué)位移53.5、54.0 ppm[35]，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白及其水解物主要以-螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在。圖5 a、5 b中化學(xué)位移24.9、25.3 ppm代表Leu的-CH3[35]，藻藍(lán)蛋白水解前后此處化學(xué)位移變化不大，說(shuō)明蛋白酶水解過(guò)程中與亮氨酸連接的酰胺鍵可能沒(méi)有斷開。而圖5 a、5 b中化學(xué)位移16.4、17.1 ppm代表Ala/Val/Thr的-CH3[32]，酶解前后該處化學(xué)位移發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明這些氨基酸連接的酰胺鍵可能被打斷，甲基碳的共振發(fā)生了變化。含有這些氨基酸的多肽可能跟藻藍(lán)蛋白中多糖連接在一起，使酶解后多糖疏水性增強(qiáng)。由圖5 e、5 g可知，藻藍(lán)蛋白與玉米直支鏈淀粉混合回生后，直鏈淀粉C1化學(xué)位移由100.3 ppm轉(zhuǎn)變?yōu)?02.4、100.3 ppm，支鏈淀粉該處化學(xué)位移由103.0、100.5 ppm轉(zhuǎn)變?yōu)?03.2 ppm。根據(jù)文獻(xiàn)[33-36]，回生淀粉此處化學(xué)位移出現(xiàn)雙峰代表存在淀粉單螺旋晶體或者淀粉處于無(wú)定型狀態(tài)，藻藍(lán)蛋白的添加使玉米直鏈回生淀粉形成單螺旋晶體或還原端碳原子由結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)，使玉米支鏈淀粉由無(wú)定型態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶態(tài)，這與表1中回生率數(shù)據(jù)結(jié)果相符。藻藍(lán)蛋白添加后對(duì)玉米直支鏈淀粉其他碳原子的化學(xué)位移影響不大。由圖5 f、5 h可知，藻藍(lán)蛋白水解物與玉米直支鏈淀粉混合回生后，直鏈淀粉所有碳原子化學(xué)位移基本沒(méi)變，與淀粉無(wú)定形區(qū)相關(guān)的化學(xué)位移由82.5減小到81.4 ppm[35]，暗示藻藍(lán)蛋白水解物促進(jìn)玉米直鏈淀粉回生可能跟無(wú)定形區(qū)變化相關(guān)。支鏈淀粉該處化學(xué)位移變化與添加藻藍(lán)蛋白基本相同，說(shuō)明從核磁上難以看出藻藍(lán)蛋白和其水解物對(duì)支鏈淀粉回生作用的差異原因。圖5 e、5 f、5 g、5 h中的172～174 ppm代表酰胺鍵，說(shuō)明這些樣品中確實(shí)有藻藍(lán)蛋白及其水解物存在，但因?yàn)楣腆w核磁衍射靈敏性或蛋白與淀粉在回生過(guò)程相互作用導(dǎo)致其他基團(tuán)信號(hào)比較弱。

圖5 玉米直鏈和支鏈淀粉混合藻藍(lán)蛋白及其水解物前后回生所得淀粉的固體核磁圖

2.7 藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米直、支鏈淀粉回生機(jī)理

根據(jù)藻藍(lán)蛋白及其水解物和玉米直支鏈淀粉混合前后所得回生淀粉的紅外和核磁分析，推測(cè)了其促進(jìn)回生機(jī)理可能途徑（圖6）。在圖6a中，藻藍(lán)蛋白在堿性蛋白酶作用下分解成不同肽段的多肽和多糖，其中多糖C6分子上還結(jié)合有親水性氨基酸Thr、Cys和Arg等，疏水性氨基酸肽Val 和Leu等。對(duì)于玉米支鏈淀粉來(lái)說(shuō)，藻藍(lán)蛋白與其混合后（如圖6c），藻藍(lán)蛋白中Arg的氨基與玉米支鏈淀粉的還原端醛基間形成氫鍵，減弱支鏈淀粉運(yùn)動(dòng)速度，緩慢甩動(dòng)過(guò)程中使支鏈淀粉末端雙螺旋解旋，不同分子間羥基形成氫鍵，生成回生淀粉；由于藻藍(lán)蛋白中的糖蛋白連接在蛋白上，沒(méi)有溶解到溶液中增加溶液粘度，不影響支鏈淀粉解旋。但當(dāng)藻藍(lán)蛋白水解物與玉米支鏈淀粉混合時(shí)（如圖6e），水解物中含有Arg的多肽分子量小、鏈長(zhǎng)短，精氨酸與支鏈淀粉形成氫鍵后，分子量大得多的支鏈淀粉在運(yùn)動(dòng)過(guò)程可以牽引多肽左右搖擺，加之水解物中多糖溶解使溶液黏度增加，玉米支鏈淀粉末端雙螺旋不能解旋，無(wú)法為回生提供更好的條件，所以不促進(jìn)支鏈淀粉的回生。對(duì)于玉米直鏈淀粉來(lái)說(shuō)，其分子量小、還原端多、移動(dòng)速度快的特點(diǎn)促使其還原端可以與藻藍(lán)蛋白中半胱氨酸的巰基間形成微弱的氫鍵（圖6b），直鏈淀粉過(guò)快的移動(dòng)速度阻礙了其與藻藍(lán)蛋白結(jié)合后雙螺旋的解旋，不能促進(jìn)其回生。而藻藍(lán)蛋白水解物分子量小，其與直鏈淀粉雙螺旋中一條鏈形成氫鍵后（如圖6d所示，直鏈淀粉還原端與藻藍(lán)蛋白水解物中精氨酸之間形成氫鍵），當(dāng)直鏈淀粉運(yùn)動(dòng)時(shí)，2條雙螺旋就容易發(fā)生解旋，使淀粉雙螺旋上羥基暴露出來(lái)，不同鏈之間更容易形成氫鍵，大大促進(jìn)了直鏈淀粉的回生。因此，淀粉還原端形成氫鍵可明顯促進(jìn)其回生。

注：Thr，Cys，Arg，His，Val，Leu分別為蘇氨酸、半胱氨酸、精氨酸、組氨酸、纈氨酸、亮氨酸。

3 結(jié) 論

藻藍(lán)蛋白可以促進(jìn)玉米支鏈淀粉回生，藻藍(lán)蛋白水解物可以促進(jìn)玉米直鏈淀粉的回生。藻藍(lán)蛋白水解物中半胱氨酸巰基可能和玉米直鏈淀粉還原端醛基在與直鏈淀粉混合回生過(guò)程形成氫鍵，通過(guò)分子甩動(dòng)使直鏈淀粉雙螺旋解開，大大促進(jìn)了玉米直鏈淀粉間形成氫鍵，提高了其回生率；而藻藍(lán)蛋白通過(guò)精氨酸氨基可能與玉米支鏈淀粉還原端醛基形成氫鍵，利用藻藍(lán)蛋白中疏水性氨基酸驅(qū)離玉米支鏈淀粉側(cè)鏈末端水分子，促使支鏈淀粉末端雙螺旋解旋，加快了支鏈淀粉末端鏈間氫鍵形成，提高了其回生率。淀粉還原端形成氫鍵可明顯促進(jìn)其回生。

研究結(jié)果表明，添加1.0%藻藍(lán)蛋白對(duì)直鏈淀粉回生率沒(méi)有影響，使支鏈淀粉回生率提高了61.4%；而添加量為10%的藻藍(lán)蛋白使直鏈淀粉回生率提高了60.4%，使支鏈淀粉回生率提高了69.6%。藻藍(lán)蛋白水解肽低的添加量（1.0%）對(duì)玉米直鏈的回生率影響不顯著，但使支鏈淀粉的回生提高了28.1%；水解肽高添加量（10.0%）使玉米直鏈淀粉的回生率提高了184.7%，使玉米支鏈淀粉的回生率提高了47.0%。

藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生的發(fā)現(xiàn)開辟了功能蛋白干預(yù)淀粉回生的新領(lǐng)域，為開發(fā)多功能保健食品、拓寬藻藍(lán)蛋白和玉米淀粉應(yīng)用領(lǐng)域找到一條新途徑。

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Mechanism of retrogradation enhancement of maize amylose and amylopectin by phycocyanin and its hydrolysate

Wang Xueqing, Jiang Rongxia, Guo Zhipeng, Lian Xijun※, Guo Junjie

(300134,)

Phycocyanin is a kind of dark blue powder isolated from spirulina and has a variety of health functions of anti-cancer, blood cell regeneration, etc. In order to widen its application in food, phycocyanin and its hydrolysis are added into maize amylose/amylopectin paste during retrogradation, it has been found that they can promote the retrogradation of amylose/amylopectin. In order to further explore its mechanism of promoting the retrogradation of maize starch, the effects of contents of phycocyanin or its hydrolysate in maize amylose/amylopectin on retrogradation rate were determined, and the method of X-ray diffraction, differential scanning calorimetry, infrared and solid nuclear magnetic analysis were used. The results showed that phycocyanin hydrolyzate promoted maize amylose retrogradation more obviously than that of phycocyanin. 10% addition of phycocyanin hydrolyzate could make maize amylose retrogradation rate increase from 27% to 76.9%, 184.8% higher. Phycocyanin promoted the retrogradation of maize amylopectin more pronouned than its hydrolysate, 10% addition of phycocyanin let maize amylopectin retrogradation rate increase from 26.7% to 45.3%, which increased by 69.6%. According to the UV-visible scanning, phycocyanin hydrolysis co cause the phycocyanin pigment in the center of phycocyanin to be exposed. X-ray results indicated that addition of phycocyanin to maize amylopectin induced a sharper peak at 2is 16.60o, as well as that mixture of phycocyanin hydrolysate and maize amylose caused a same sharper one at 2is 16.44o. Compared to diffraction angles of retrograded maize amylose/amylopectin, the decrease of sharp diffraction angle in those mixtures supported that interplanar distance at this angle became larger. DSC results demonstrated that mixture of phycocyanin and maize amylopectin, or mixture of phycocyanin hydrolysate and maize amylose, which both promoted retrogradation greatly, both caused the presence of re-crystallization peaks and loss of crystallization peaks. In other words, more phycocyanin/hydrolysate chains and maize amylose/amylopectin with similar length involved in retrogradation. Such process should deal with unwinding of maize amylose/amylopectin. The results of infrared and13C solid NMR showed that phycocyanin might be hydrolyzed into arginine-rich polypeptide with hydrophilic, polysaccharides and polypeptide with hydrophobic. The mechanism for phycocyanin to promote retrogradation of maize amylopectin was that the formation of hydrogen bond between the arginine amino acid of phycocyanin and aldehyde of reduction end in maize amylopectin, and water molecule of maize amylopectin being driving away from the side chain end by phycocyanin hydrophobic amino acid, promoted the end of the chain-branched starch double helix spin, accelerate the formation of hydrogen bond between the end chains of amylopectin, which lead to improve retrogradation rate of maize amylopectin. The mechanism for phycocyanin hydrolysate to increase retrogradation rate of maize amylose was that the hydrogen bond formed between the sulfydryl of cysteine in phycocyanin hydrolyzate and aldehyde of reduction end in maize amylose during retrogradation of mixture, then the double helix of amylose was unlocked by molecular swinging, which greatly promoted the formation of hydrogen bond between amylose and improved the retrogradation rate of amylose. This study provides a new technique to improve the retrogradation rate of maize starch.

agricultural products; starch; hydrolysis; retrograded starch; phycocyanin; retrogradation mechanism

2018-10-25

2019-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571834；31871811）；天津市科技重大專項(xiàng)與工程（一二三產(chǎn)業(yè)融合發(fā)展科技示范工程）（項(xiàng)目編號(hào)18ZXYENC00080）；天津市高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810069067）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“農(nóng)產(chǎn)品加工貯藏新新技術(shù)及相關(guān)機(jī)理研究”（編號(hào)TD13-5087）；天津市自然科學(xué)基金（18JCZDJC98200）資助

王雪青，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物的研究開發(fā)及應(yīng)用。Email：wxqing@tjcu.edu.cn

連喜軍，博士，副教授，主要從事回生淀粉研究。 Email：lianliu2002@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.08.038

TS231

A

1002-6819(2019)-08-0324-11

王雪青，蔣榮霞，郭志鵬，連喜軍，郭俊杰. 藻藍(lán)蛋白及其水解物促進(jìn)玉米直支鏈淀粉回生機(jī)理研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(8)：324－334. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.08.038 http://www.tcsae.org

Wang Xueqing, Jiang Rongxia, Guo Zhipeng, Lian Xijun, Guo Junjie. Mechanism of retrogradation enhancement of maize amylose and amylopectin by phycocyanin and its hydrolysate[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(8): 324－334. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.08.038 http://www.tcsae.org