李禮斌 楊 絮 胡軼娟 童曄玲 劉培剛#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

三葉青屬于葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，是我國一種珍稀的藥用植物，以塊根或者全草入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效[1］。其抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)促進了三葉青在腫瘤臨床治療上的應(yīng)用及其相關(guān)分子機理研究的開展[2］。三葉青在我國長江以南地區(qū)分布，其中浙江省和廣西壯族自治區(qū)是其兩個主要產(chǎn)地，且兩地的三葉青在性狀和藥效方面存在一定的差異[3］。有關(guān)三葉青活性物質(zhì)在不同提取方法、不同產(chǎn)地的活性物質(zhì)浸出差異及抗腫瘤活性研究報道相對較少。因此，本研究就不同提取方法對不同產(chǎn)地三葉青乙醇浸提物與黃酮類活性成分含量及抗肺癌細(xì)胞A549增殖活性等影響展開研究，以期為三葉青等中藥材活性成分提取、制劑工藝及臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料：2種三葉青樣品（塊莖）分別采自浙江省溫嶺市和廣西壯族自治區(qū)天峨縣，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院藥用資源研究中心浦錦寶研究員鑒定，分別為兩產(chǎn)地的葡萄科植物三葉青T.hemsleyanum塊莖，樣本存放于浙江省中醫(yī)藥研究院藥用資源研究中心藥用植物標(biāo)本室。

1.2 藥材提取工藝：兩產(chǎn)地新鮮三葉青塊莖洗凈晾干后經(jīng)切片機切片，一部分保留，用作鮮切片浸提，另外樣本在45℃條件下烘干留作加熱回流與干切片常溫浸提用。加熱回流法：各取浙江產(chǎn)和廣西產(chǎn)三葉青干切片30g，按照1∶20比例加入600ml 75%的乙醇，80℃條件下提取1.5h，提取2次后合并提取液，并定容到1200ml。常溫浸提法：①干切片：各取浙江產(chǎn)和廣西產(chǎn)三葉青干切片30g，按照1∶20比例加入600ml 75%的乙醇，常溫條件下提取10d，提取2次，最后合并提取液體并定容到1200ml。②鮮切片：按照每8g鮮切片獲取1g干切片的比例，各取浙江產(chǎn)和廣西產(chǎn)三葉青干切片240g，按照1∶20比例加入600ml 75%的乙醇，常溫條件下提取10d，常溫條件下提取10d，提取2次，最后合并提取液體并定容到1200ml。

1.3 不同工藝下三葉青乙醇浸提物及總黃酮含量測定：將蒸發(fā)皿洗干凈，放在105℃+2℃的烘箱中烘3h，放在干燥器內(nèi)冷卻后稱量，反復(fù)烘干，冷卻，稱量，直至恒重（兩次稱量的重量差不超過0.5mg），放在干燥器內(nèi)備用。各取上述樣本200ml，置于備用培養(yǎng)皿中，置于水浴鍋上揮干后放在105℃+2℃的烘箱中烘3h，放在干燥器內(nèi)冷卻后稱量，然后計算三葉青乙醇浸提物含量。采用紫外分光光度法，參照文獻[4］測定方法與流程進行上述三葉青各處理樣本總黃酮浸出的含量測定。

1.4 UPLC指紋圖譜分析：采用UPLC技術(shù)對上述不同工藝下三葉青乙醇浸提液指紋圖譜進行檢測。色譜條件為：ACQUITYTMBETC18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），DAD檢測器；流動相為乙腈（A）-100%甲醇）（B），流速0.2ml·min-1，柱溫30℃，進樣量2μl，洗脫0～10min，甲醇5%～100%，10～12min，甲醇100%。

1.5 腫瘤細(xì)胞抑制實驗：腫瘤細(xì)胞抑制實驗開始前，先將上述各樣本在水浴（60℃）揮干，然后加1ml RPMI-1640培養(yǎng)基溶解，配置成3g（生藥）/ml的樣本備用，用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。取對數(shù)生長期A549細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶進行消化后，以5000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度[（31.25μg（生藥）/ml）～1000μg（生藥）/ml］的上述含各三葉青提取物溶液100μl，共6個梯度，對照組加培養(yǎng)液，每種濃度重復(fù)3孔，重復(fù)3次，另設(shè)1個空白對照孔，處理48h后采用CKK-8法測定細(xì)胞活性。

2 結(jié)果

2.1 不同處理工藝兩產(chǎn)地三葉青乙醇浸提物含量比較：具體數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果顯示：鮮切片常溫浸提法獲得乙醇浸提物含量較其他2種提取工藝要高，但是浸提物中所含黃酮比率最低；加熱回流提取下，浙江產(chǎn)三葉青乙醇浸提物及黃酮含量均高于廣西產(chǎn)三葉青；常溫浸提工藝下，廣西產(chǎn)三葉青乙醇浸提物含量均高于浙江產(chǎn)三葉青；干切片不管是加熱回流法還是常溫浸提法，浙江產(chǎn)三葉青黃酮浸出量均高于廣西產(chǎn)三葉青。3種工藝下，浙江產(chǎn)三葉青黃酮浸出量占乙醇浸提物量比率均高于廣西產(chǎn)三葉青。

表1 不同處理工藝兩產(chǎn)地三葉青黃酮類物質(zhì)含量

2.2 不同處理工藝三葉青乙醇浸提物指紋圖譜：采用UPLC法對兩大產(chǎn)地三葉青在不同提取方法下進行了指紋圖譜研究分析（見圖1）。結(jié)果表明，加熱回流法工藝下，兩產(chǎn)地三葉青所浸出的乙醇浸提物化學(xué)成分在種類上差異性較小，而常溫浸提工藝下，不管是干切片還是鮮切片，兩產(chǎn)地三葉青所浸出的乙醇浸提物化學(xué)成分在種類上均存在明顯的差異。同一品種間，不同處理工藝間三葉青所浸出的乙醇浸提物化學(xué)成分在種類上均存在明顯差異，推測可能是由于溫度影響到了一些活性成分的穩(wěn)定性和鮮品中一些活性物質(zhì)浸出較慢等。

圖1 兩產(chǎn)地不同提取工藝三葉青乙醇浸提物指紋圖譜

2.3 不同處理工藝三葉青乙醇浸提物腫瘤抑制效果比較：圖2顯示，兩產(chǎn)地不同處理三葉青乙醇浸提物處理48h對肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制效果存在一定的差異，但是都呈現(xiàn)劑量依賴性。不管何種處理，浙江產(chǎn)三葉青乙醇浸提物在同一濃度下對于肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制效果要優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青，特別是干切片常溫浸提工藝下。同一品種不同處理間腫瘤抑制效果存在一定的差異，其中，浙江產(chǎn)三葉青干切片常溫浸提抑制效果最好，而廣西產(chǎn)三葉青干切片常溫浸提抑制效果最差。

圖2 兩產(chǎn)地不同處理三葉青黃酮類物質(zhì)腫瘤抑制效果

3 討論

研究顯示，三葉青可以通過多途徑、多靶點協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，其中三葉青黃酮是一類重要的抗腫瘤活性成分，在三葉青中含量占到了2%～9%[5-6］。中藥材藥效與活性物質(zhì)含量及組成存在密切的關(guān)系，而提取方法的不同又將會影響到中藥材活性物質(zhì)的浸出及組成[7］。本研究結(jié)果顯示：不同的提取工藝對于三葉青黃酮類物質(zhì)的浸出具有一定的影響；這也是不同處理工藝下三葉青藥效存在一定差異的原因，三葉青中發(fā)揮主效腫瘤抑制效果的活性物質(zhì)的浸出率影響了抑制效果；不同產(chǎn)地三葉青腫瘤抑制效果差異跟不同品種間乙醇浸提物含量及黃酮含量差異不存在相關(guān)性，可推測腫瘤抑制效果可能跟浸提物種主要藥效活性物質(zhì)含量差異相關(guān)，而三葉青中主要藥效活性物質(zhì)也將有待進一步進行分析。因此，在腫瘤等疾病的防治上，選擇優(yōu)質(zhì)的道地性藥材及合適炮制工藝對于療效顯得至關(guān)重要。本研究結(jié)果將會為三葉青的臨床應(yīng)用選擇和炮制工藝選擇提供一定的數(shù)據(jù)支持。