祁巖龍，孫文敏，孫儷娜*

1. 新疆農業(yè)科學院綜合試驗場（烏魯木齊 830000）；2. 新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院（烏魯木齊 830000）；3. 新疆農業(yè)科學院農業(yè)機械化研究所（烏魯木齊 830052）

核桃，胡桃科中的核桃屬，是全球重要的堅果樹種，目前是我國栽培種植范圍最大的樹種之一[1-2]。奚聲珂[3]將中國核桃初步分為四類，新疆核桃作為其中一個地理生態(tài)型，若能充分利用新疆核桃資源的優(yōu)勢，深入研究核桃產品生產工藝，豐富核桃精深加工產品，延伸核桃產業(yè)鏈，對新疆及核桃產業(yè)的發(fā)展都具有重要意義。

核桃可食用可入藥，有“腦黃金”的美名[4]；核桃中主要蛋白質為谷蛋白，約占核桃蛋白總含量的70%，具有人體必需的8種氨基酸，這8種氨基酸的比例與人體所需含量接近，美國農業(yè)部稱其是一種優(yōu)質的蛋白，核桃蛋白富含精氨酸，而賴氨酸和精氨酸的比值為0.16～0.19，攝入較多的精氨酸或較低的賴氨酸和精氨酸的比值有降低冠心病與動脈粥樣硬化的作用，因此核桃蛋白具有治療心血管疾病的輔助作用[5-6]。核桃蛋白質由大量多肽組成，分子量為12～67 kDa。通過研究表明，核桃多肽具有抗氧化作用[7]；核桃多肽能夠降低血清中甘油三酯及總膽固醇的水平[8]；處理過的核桃蛋白質生產出的生物活性肽的功能特性更好，小分子肽相對于氨基酸的吸收會更快，且吸收率更大，無抗原性使得食用后不會過敏[9-10]；此外，核桃仁中鐵、磷、鉀、鈣等微量元素含量較高，還含有維生素A、維生素B1、維生素B2等[11]。

核桃蛋白中谷蛋白含量最高，又因其中疏水性氨基酸含量較高，導致核桃蛋白溶解性比較低，可將核桃蛋白制成多肽的方法增加其溶解性[12]。由于生物活性肽的研究進展較快，為核桃多肽的制備提供了研究方向和技術。目前，核桃多肽制備的重點在蛋白酶水解法，因其生產條件溫和，特異性強，而且無毒副作用等優(yōu)勢，已成為蛋白質改性的主要方法[13]。試驗采用生物酶水解法，對核桃蛋白進行水解，在此基礎上選擇不同的酶解時間、液料比等條件，通過考察酶解后的核桃蛋白的水解度（DH）、氮溶指數（NSI）和分子量分布表征蛋白酶的水解效果，為核桃的精深加工生產提供理論依據。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

核桃，產自新疆阿克蘇，溫185；胰蛋白酶（2.5×105U/g）、中性蛋白酶（6×104U/g）、風味蛋白酶（2.0×104U/g）、復合蛋白酶（5×105U/g），北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、硫酸、氫氧化鈉，均為分析純，天津光復試劑。

標準品：還原型谷胱甘肽（MW310 Da）、細胞色素C（MW12 500 Da）、甘氨酸（MW190 Da）、枯草桿菌肽（MW1 450 Da）、抑菌肽（MW6 500 Da），美國Sigma公司。

1.2 設備與儀器

QYZ型液壓榨油機（泰安市良君益友機械有限公司）；DHSZ-300 A型水浴恒溫振蕩器（蘇州培英實驗設備有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；OPD型噴霧干燥機（上海大川原干燥設備有限公司）；K 1160型全自動凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）。

2 試驗方法

2.1 制備核桃蛋白

2.2 核桃餅蛋白含量測定

去皮核桃仁經過冷榨后得到的核桃粉，采用凱氏定氮法[14]測定核桃粕中的蛋白含量，試樣中蛋白質含量按式（1）計算：

式中：X為樣品中每百克蛋白質的含量，g/100 g；V1為樣品消耗鹽酸或硫酸標準液的體積，mL；V2為空白試驗時試劑消耗的鹽酸或硫酸標準液的體積，mL；c為硫酸或鹽酸標準滴定摩爾濃度，mol/L；V3為吸取的消化液的體積，mL；m為試樣的取樣量，g；0.014 0為1.0 mL的摩爾濃度1.000 mol/L的鹽酸或硫酸標準液相當的氮的質量，g；F為氮換算為蛋白質的系數，核桃蛋白的F值為5.3，蛋白含量以干基計。

2.3 蛋白質水解度測定

水解度（DH）采用pH-Stat測定[15]。首先將樣液調至最適pH，反應至結束期間需不斷加入NaOH標準溶液以維持溶液pH，結束時記錄NaOH標準液所消耗的體積，按式（2）計算：

式中：B為試驗中堿液體積，mL；Nb為堿液濃度，mol/L；htot為底物蛋白質肽鍵的總數，mmol/g，取值8.0；Mp為試驗中底物蛋白質的質量，g；α為蛋白質中α-氨基的解離度。

α-氨基解離度按式（3）計算：

式中：α-氨基的解離常數pK，一般取值7.0。

2017年4月9日至22日，天成控股時任董事長王某生，多次向實控人匯報天成控股2016年年報審計工作情況，實控人系法定內幕信息知情人。

2.4 氮溶指數的測定

參照文獻[16]氮溶指數（NSI）的試驗方法，用凱氏定氮儀測定其蛋白質含量，氮溶指數按式（4）計算：

式中：N1是量取的5 mL上清液中可溶性氮含量，mg；N2是試驗中2 g樣品的總氮含量，mg。

2.5 核桃蛋白酶解操作過程

將核桃粉根據液料配比加入一定量的蒸餾水，攪拌均勻，加入1% NaOH調至pH 7.0，放入水浴鍋升溫至45 ℃時恒溫，加入適量的酶進行反應，反應過程中注意pH需保持在7.0，到達預定的時間后，于90 ℃滅酶10 min。測定其水解度和氮溶指數。

2.6 核桃蛋白酶解試驗

2.6.1 核桃蛋白酶的選擇

根據選擇的標準，試驗選用的蛋白酶在中性環(huán)境下有較高的活性，最適pH在7.0左右，可以減少產品后期處理酸和堿的用量，降低成本，降低環(huán)境污染可能性；內切酶與端切酶結合或者這種酶的作用位點是隨機的。初步選定了胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶4種水解酶。分別選定了此4種水解酶在溫度45 ℃、酶添加量1 000 U/g、酶解時間60 min等條件下測定水解度。

2.6.2 液料比的確定試驗

選擇合適的蛋白酶后，在酶解條件（pH 7.0，溫度45 ℃，添加量1 000 U/g）下，液料比為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1（mL/g），通過考察水解度和氮溶指數來確定合適的料液比。

2.6.3 核桃蛋白酶解時間確定試驗

選擇最適蛋白酶酶解核桃蛋白，按選定的液料制備5份核桃蛋白水溶液，每份溶液1 L。用0.1% NaOH調節(jié)底物溶液pH 7.0，在45 ℃恒溫水浴搖床上分別處理60，120，180，240和300 min。處理結束后考察核桃蛋白水解液的水解度（NSI）、氮溶指數（DH）。

2.7 核桃多肽的制備

選定適合的酶解時間及最適液料比后進行酶解，加入篩選出的酶，酶解條件：加酶量4 000 U/g（以蛋白計），溫度45 ℃、pH 7.0，搖床轉速120 r/min。酶解結束后于90 ℃滅酶10 min，離心（4 400 r/min，15 min），取上清液，過濾，噴霧干燥（進風溫度170℃，出口溫度80 ℃），備用。

2.8 核桃多肽分子量分布的測定

根據上述條件與方法制備核桃多肽后，準確稱取0.200 g樣品，用去離子水定容至100 mL，吸取1.0 mL用流動相定容至10 mL，經微孔膜過濾后待用。

將還原型谷胱甘肽、細胞色素C、甘氨酸、枯草桿菌肽、抑菌肽5種標準品用流動相配制成1 μg/mL的標準品溶液，標準品分子量見表1。

采用Agilent 1200高效液相色譜儀。色譜柱為TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相為V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=45∶55∶0.1；檢測波長為UV 220 nm；流速為0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

表1 標準品與其分子量

2.9 數據處理

試驗數據為3個試驗樣本的平均值，采用Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析和計算。

3 試驗結果

3.1 核桃粕的蛋白含量測定

試驗得出核桃粕中的蛋白含量為48.496%。

3.2 蛋白酶的篩選試驗

酶的種類與相對應的酶解產物的水解度見表2。在其他條件相同的情況下，四種蛋白酶都能在不同程度上水解核桃蛋白，但不同蛋白酶的作用效果不同。根據測定結果中水解度可見四種蛋白酶對核桃蛋白的水解能力大小為：復合蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞風味蛋白酶。其中，復合蛋白酶與胰蛋白酶的酶解產物的水解度最高，達到3.31%和3.24%，胰蛋白酶的酶解產物相對復合蛋白酶的酶解產物的水解度較低。然而，水解程度高會導致苦味肽的生成，導致產品的口感嚴重受損[17]，故最終選擇胰蛋白酶作為試驗所用水解酶進行下一步試驗。

表2 酶的種類與其酶解產物的水解度

3.3 液料比的確定

由圖1和圖2可知，當液料比為5∶1（mL/g）時，此時底物濃度最大，樣液的水解度最小為0.58%；液料比在10∶1（mL/g）氮溶指數達到最大，水解度為3.31%；之后水解度逐漸降低。氮溶指數均在30%以上；當液料比為20∶1（mL/g）時，樣液氮溶指數最小，為30.84%；液料比在10∶1（mL/g）時氮溶指數最大，為38.25%。故選擇10∶1（mL/g）為最適液料比。

圖1 液料比對水解度的影響

圖2 液料比對氮溶指數的影響

3.4 核桃蛋白酶解時間的確定

在其他條件不變的情況下，胰蛋白酶解時間的長短對氮溶指數和水解度的影響見圖3和圖4。在同一種酶作用下，水解時間的不同會對水解效果有不同的影響，而蛋白酶需要一定的時間才能充分反應。在此條件下，核桃蛋白隨著酶解時間的延長，水解度和氮溶指數均呈上升趨勢，反應初期，核桃蛋白水解度和氮溶指數迅速增大，而到達4 h后開始趨于平緩。結果顯示，當時間為300 min時，水解度和氮溶指數分別達到最高，水解度為39.36%，氮溶指數為70.18%；當時間為240 min時，水解度和氮溶指數分別為39.31%和69.61%，與300 min時水解度和氮溶指數相差不大，即超過240 min水解度和氮溶指數增加不明顯，考慮到成本問題，因此選擇酶解時間240 min。

3.5 核桃多肽分子量分布的測定結果

由表3可知，試驗所得核桃多肽的分子量主要分布在6 500～12 500 Da之間，占比49.74%，分子量小于1 450 Da的低分子量多肽含量為36.33%。而未經過酶水解的核桃蛋白質分子量大多在12 000 Da以上。從表3中可看到酶解后的分子量大于12 500 Da的降低至18.22%，表明經過處理的核桃蛋白確實能夠較好地水解成小分子的肽。

圖3 不同酶解時間對水解度的影響

圖4 不同酶解時間對氮溶指數的影響

表3 核桃多肽的分子量所占百分比

4 分析與討論

4.1 分析

4.1.1 核桃餅的蛋白含量分析

田婭玲[18]研究顯示，未處理過的核桃含蛋白質的量為19.23%，核桃脫脂粉含蛋白質的量為64.69%，蛋白粉的蛋白含量為80.56%，多肽粗品的蛋白含量更是高達96.15%。試驗經冷榨后的蛋白含量能夠達到48.496%。

4.1.2 不同蛋白酶與水解度的關系分析

因酶具有專一性，一種酶只能催化一種或一類底物，而蛋白酶只對多肽鍵中特定的肽鍵起催化作用，但多肽分子具有多種不同的肽鍵[19]，故不同的單一蛋白酶的水解效果各不相同。

4.1.3 液料比分析

當液料比為5︰1（mL/g）時，此時底物濃度最大，樣液的水解度最小，為0.58%?？赡苁俏阶饔枚沟鞍踪|聚合，形成網狀的聚合體，使酶解速率降低[20]。而當液料比為20∶1（mL/g）時，氮溶指數最小，可能是液料濃度低，酶未被底物完全飽和導致。

4.1.4 核桃蛋白酶解時間分析

水解度速率先大后小可能是酶促水解反應會受底物濃度影響。開始反應時，底物濃度高，酶會被底物完全飽和，水解速度快，隨著水解時間延長，其酶切位點減少，游離肽增多，抑制產物的生成，水解速度會趨于平緩，也可能酶活力的降低導致水解速度減緩[21]。

4.2 討論

多數的蛋白產品僅僅在于蛋白質的提取，而少于對蛋白質的進一步改性研究，導致產品功能特性較差[22]，產品的商業(yè)價值和營養(yǎng)價值均大大降低，因此對蛋白質進行不同的理化處理從而生產出功能特性較高的產品是重要的研究方向之一。試驗采用酶水解法，相比較酸或堿水解法有較大優(yōu)勢：蛋白質在人體內是以肽的形式吸收，酶水解核桃蛋白并非氨基酸而是肽，所以人體更易吸收，且生產效率高，反應條件溫和，不破壞氨基酸，安全性高[23-24]。試驗采取單酶水解，相對于多酶水解法的水解度等結果較低，因多酶水解法含有較多種類的酶，其酶的底物特異性也會較廣，作用位點多，反應速率更快，水解度更好，通過依次加酶的方式也能更好地保證各酶的最佳反應條件，所以試驗依舊有其需要改進的地方。

5 結論

根據試驗結果，在選定了適合的溫度、pH、酶添加量等條件下，以水解度和氮溶指數作為指標，在有限的四種蛋白酶中選取最適酶進行酶解，同時考慮生產的產品口味而選擇胰蛋白酶作為核桃蛋白的水解酶，在此基礎上，篩選的其他條件為：液料比10∶1（mL/g），水解時間240 min，溫度45 ℃，pH 7.0，加酶量4 000 U/g（以蛋白計）。此條件下核桃蛋白的水解度和氮溶指數最高，分別為39.31%和69.61%；核桃多肽分子量小于1 450 Da的低分子量多肽含量為36.33%。結果顯示：酶的種類、反應時間、液料比等方面對提取核桃多肽均有較大影響。