邵婷，劉昕，黎重陽(yáng)，鐘金鋒，覃小麗

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶，400715)

辣木是產(chǎn)于北印度的多年生速生樹(shù)種。目前，我國(guó)已在云南、福建、廣西等省份引進(jìn)辣木品種并形成種植規(guī)模[1]。辣木的葉、種子及根等部分均可食用，富含多種維生素、礦物質(zhì)元素且具有藥理活性，是一種兼具優(yōu)良保健和治療作用的藥食同源性植物。辣木籽中含有豐富的油脂(約39%)和蛋白質(zhì)(約36%)[2]。其中，辣木籽油中油酸含量高達(dá)68%[3]，油酸具有降低膽固醇和調(diào)節(jié)血脂等作用；辣木籽中蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于其在莖、葉、籽殼中的含量，且含有人體所需的全部必需氨基酸[4]，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)。因此，研究合適的高效提取方法，分離得到辣木籽的蛋白質(zhì)、油脂等主要營(yíng)養(yǎng)成分，在功能食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面具有重要意義。

目前，對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)的研究主要集中在脫脂辣木籽中蛋白質(zhì)的分級(jí)提取及其在水處理中的效果[3，5]，以及水酶法同時(shí)提取辣木籽油和蛋白質(zhì)等方面[6-8]。

蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)提取法中所需提取時(shí)間較長(zhǎng)(通常大于1 h)[9]，不利于其提取效率的提高。近年來(lái)，超聲波輔助法因其在提取蛋白質(zhì)過(guò)程中具有耗時(shí)短、純度高、有利于改善蛋白功能性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于大豆、花生蛋白質(zhì)的提取[10-11]。目前，已有的報(bào)道多集中在利用超聲輔助法提取辣木籽油[3]以及辣木葉多酚[12]、黃酮[13]和蛋白質(zhì)[14]的工藝研究中。然而，關(guān)于辣木籽蛋白質(zhì)的分離提取的研究報(bào)道還很少，尤其是利用超聲輔助提取辣木籽蛋白質(zhì)的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文以脫脂辣木籽為原料，采用超聲輔助法提取辣木籽蛋白質(zhì)，考察超聲功率、液料比、NaCl濃度、提取pH和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，以期提高辣木籽蛋白質(zhì)的提取效率以及為其開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽，產(chǎn)于北印度喜馬拉雅區(qū)，購(gòu)于昆明中藥材市場(chǎng)；石油醚(沸程60～90 ℃)，購(gòu)于重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250和牛血清蛋白，購(gòu)于合肥志宏生物技術(shù)有限公司；其他試劑均屬于分析純；超純水，由YSL-RO-T10L/H超純水系統(tǒng)(Ashland公司)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

GM-K20型加熱破壁料理機(jī)，佛山市順德區(qū)格明電器實(shí)業(yè)有限公司；Scientz-800CQ型超聲波提取震蕩反應(yīng)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；RW20數(shù)顯型混合頂置式機(jī)械攪拌器，德國(guó)IKA公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；H4-20KR型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；PB-10 pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣木籽蛋白的提取方法

將辣木籽粉碎并過(guò)40目篩，用沸程為60～90 ℃的石油醚(m(辣木籽粉)∶v(石油醚)=1∶6)在30 ℃下攪拌(500 r/min，40 min)脫脂，重復(fù)提取2次。把經(jīng)過(guò)二次脫脂后的辣木籽粉置于通風(fēng)櫥內(nèi)至石油醚完全揮發(fā)得到脫脂辣木籽粉(蛋白質(zhì)含量為54.63%)。將脫脂辣木籽粉與一定濃度的NaCl溶液按一定比例混合，用1.00 mol/L的HCL調(diào)節(jié)混合液pH至一定值后在一定溫度下超聲攪拌提取。然后，將提取混合液在4 ℃下離心(4 630×g,15 min)，過(guò)濾，收集上清液；對(duì)所得沉淀進(jìn)行第二次超聲提取，最后合并2次超聲提取的上清液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察超聲功率(0～240 W)、液料比(10∶1～60∶1，mL∶g)、NaCl濃度(0～1.75 mol/L)、pH(4.00～11.00)及超聲提取時(shí)間(5～20 min)對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在辣木籽蛋白質(zhì)提取的單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken模型，以液料比、NaCl濃度、pH為自變量，辣木籽蛋白質(zhì)提取兩次的提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(表1)。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)因子水平編碼表Table 1 Factor coding and levels of Box-Benhnkenexperiments

1.3.4 蛋白質(zhì)的沉淀試驗(yàn)

以蛋白質(zhì)沉淀率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察鹽析體系中NaCl濃度(2.56、3.42、4.27 mol/L)對(duì)上清液中蛋白質(zhì)沉淀率的影響。具體操作為：將最佳提取條件下所得的上清液pH調(diào)至10.00后加入一定質(zhì)量的NaCl，在室溫下靜置2 h后離心(8 230×g,15 min)，過(guò)濾，收集沉淀，將沉淀透析72 h，透析液冷凍干燥后得到純化后的辣木籽蛋白粉；同時(shí)測(cè)定離心后上清液的蛋白質(zhì)濃度以計(jì)算蛋白質(zhì)沉淀率。

1.3.5 蛋白質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定方法

采用凱氏定氮法[15]對(duì)脫脂辣木籽粉和鹽析純化后辣木籽蛋白粉中總蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法[16]對(duì)蛋白質(zhì)提取中上清液蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定；牛血清蛋白濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=44.54x+0.019 3，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。蛋白質(zhì)提取率、蛋白質(zhì)純度和蛋白質(zhì)沉淀率分別按公式(1)、(2)和(3)計(jì)算。

(1)

(2)

(3)

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各樣品的指標(biāo)平行測(cè)定至少2次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果。采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05時(shí)判斷組間存在顯著差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在液料比為30∶1，pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為15 min，NaCl濃度為0.500 mol/L，提取2次的條件下，超聲功率對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1所示。當(dāng)超聲功率從0 W增加到120 W時(shí)，辣木籽蛋白質(zhì)的提取率明顯提高了14.54%(P<0.05)。這可能是因?yàn)殡S著超聲功率在一定范圍內(nèi)的增加，超聲波振蕩頻率增加，液體中的壓力增大，超聲波的空氣化作用和機(jī)械剪切力作用得到增強(qiáng)，脫脂辣木籽細(xì)胞壁的破壞速度加快，進(jìn)而更有利于蛋白質(zhì)分子展開(kāi)并與溶劑接觸，最終促進(jìn)了蛋白質(zhì)溶解于提取液中[17]。然而，當(dāng)超聲功率從120 W增加到240 W時(shí)，提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)并趨于平緩。其原因可能是較大超聲功率會(huì)使空化氣泡來(lái)不及破裂，空氣化作用效率降低，并且會(huì)增加散射衰減，形成聲屏障，這使蛋白質(zhì)分子間的黏滯性增強(qiáng)，提取率降低[18-19]。因此，確定辣木籽蛋白質(zhì)提取的最佳功率為120 W。

圖1 超聲功率對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extractability of protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.1.2 液料比對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間15 min，提取功率為120 W，NaCl濃度為0.500 mol/L，提取2次的條件下，液料比對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響如圖2所示。當(dāng)液料比從10∶1增大到40∶1時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率提高較快，增加了29.80%，這可能是由于溶劑的適量增加使得辣木籽在溶劑中的接觸面積與分散度增大，擴(kuò)散作用增強(qiáng)[20]。當(dāng)液料比大于40∶1后，蛋白質(zhì)的提取率繼續(xù)增大，但增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩。雖然蛋白質(zhì)提取率隨著液料比的增大(10∶1～60∶1)而不斷提高，但是上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度從18.35 mg/mL下降到4.022 mg/mL，濃度太小會(huì)增加后續(xù)蛋白質(zhì)濃縮純化的負(fù)擔(dān)，這在工業(yè)生產(chǎn)中尤為明顯。因此，不再對(duì)更大液料比進(jìn)行試驗(yàn)探究，選擇液料比40∶1為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖2 液料比對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of the liquid-solid ratio on the extractabilityof protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.1.3 NaCl濃度對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在液料比為40∶1，pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間15 min，提取功率為120 W，提取2次的條件下，NaCl濃度對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響如圖3所示。當(dāng)NaCl濃度從0增大至0.250 mol/L時(shí)，辣木籽蛋白質(zhì)的提取率從7.78%迅速增大至70.68%，這表明了辣木籽蛋白質(zhì)主要為鹽溶性蛋白質(zhì)。當(dāng)NaCl濃度增加至1.00 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)提取率緩慢增加至最大值(80.80%)，這可能由于較低濃度的NaCl溶液(≤1.00 mol/L)中Cl-與蛋白質(zhì)分子帶電基團(tuán)發(fā)生微弱結(jié)合，促進(jìn)了蛋白質(zhì)溶解于溶劑中。然而，繼續(xù)增大NaCl濃度至1.75 mol/L時(shí)，辣木籽蛋白質(zhì)提取率顯著下降了9.43%，這可能是在高濃度鹽溶液中蛋白質(zhì)發(fā)生了鹽析作用，降低了辣木籽蛋白質(zhì)的溶解度。因此，確定提取辣木籽蛋白質(zhì)最佳NaCl濃度為1.00 mol/L。

圖3 NaCl溶液濃度對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on the extractability of protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.1.4 pH對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在液料比為40∶1，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為15 min，提取功率為120 W，NaCl濃度為1.00 mol/L，提取2次的條件下，pH對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響如圖4所示。

圖4 pH對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extractability of protein from thedefatted Moringa oleifera seed flour

辣木籽蛋白質(zhì)在鹽溶體系中性偏酸性條件(pH 6.00)下提取率最高(79.03%)，此現(xiàn)象與汪國(guó)威等[6]采用水酶法制備辣木籽蛋白質(zhì)得到最佳pH的結(jié)果一致。當(dāng)提取液的pH大于6.0時(shí)，辣木籽蛋白質(zhì)提取率開(kāi)始下降，并在pH 10.0和11.0時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最低(63.09%和62.79%)，這與大多數(shù)植物蛋白質(zhì)在弱堿性(pH 7.50～9.00)條件下隨著堿性增強(qiáng)提取率增大的現(xiàn)象[21-22]相反，反映了辣木籽蛋白質(zhì)中含有較多的堿性蛋白質(zhì)。在pH為11.00時(shí)，提取液開(kāi)始有腥味產(chǎn)生，這可能是在此強(qiáng)堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)小部分水解產(chǎn)生氨基酸。因此，確定提取辣木籽蛋白質(zhì)的最佳pH為6.00。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在液料比為40∶1(mL∶g)，pH為6.00，提取溫度為40 ℃，提取功率為120 W，NaCl濃度為1.00 mol/L，提取2次的條件下，提取時(shí)間對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響如圖5所示。當(dāng)提取時(shí)間由5 min延長(zhǎng)至15 min時(shí)，辣木籽蛋白質(zhì)的提取率由75.63%顯著提高至79.04%。這可能是因?yàn)槔蹦咀逊勰┑娜苊浶枰欢〞r(shí)間，充分溶脹更有利于蛋白質(zhì)的溶解[23]。然而，當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至20 min時(shí)，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但降低不顯著(P>0.05)。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)在長(zhǎng)時(shí)間超聲波的空化效應(yīng)下會(huì)被破壞而發(fā)生變性沉淀，離心過(guò)濾時(shí)被去除，所以測(cè)出上清液中蛋白質(zhì)含量偏低[24]。因此，確定提取辣木籽蛋白質(zhì)的最佳時(shí)間為15 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extractability of protein from the defatted Moringa oleifera seed flour

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

考慮到不同因素之間可能存在協(xié)同交互作用，因此基于單因素試驗(yàn)選擇NaCl濃度、液料比和pH作為Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的變量，以蛋白質(zhì)提取率作為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)表2的數(shù)據(jù)分析計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，建立了以蛋白質(zhì)提取率(Y)對(duì)液料比(A)、NaCl溶液濃度(B)和pH(C)二次回歸模型：Y=79.28+9.70A+0.83B+1.29C+0.42AB-1.54AC-1.30BC+0.048A2-5.50B2-7.01C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。回歸模型F=58.30，P<0.000 1，說(shuō)明回歸模型具有高度顯著性，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。失擬項(xiàng)F=5.72，P=0.063 5>0.05，說(shuō)明回歸模型失擬項(xiàng)不顯著，試驗(yàn)點(diǎn)均能用模型描述。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.986 8，說(shuō)明模型的擬合度較好，回歸方程是可靠的。決定系數(shù)為0.969 9，說(shuō)明該模型能夠解釋96.99%響應(yīng)值的變化，可以對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。從回歸模型顯著性系數(shù)檢驗(yàn)可以看出模型一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)B2和C2極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)C顯著(0.010.05)，說(shuō)明NaCl濃度對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響不大，及各因素之間的交互作用不明顯。以此判斷出各因素對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響程度依次為：液料比>pH>NaCl濃度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

因素交互作用對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率影響的等高線與響應(yīng)面圖如圖6所示。曲面越陡峭說(shuō)明該因素對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響越顯著[25]。由圖6-a可知，pH為6.00時(shí)，相對(duì)于NaCl濃度的變化曲面，液料比的變化曲面更陡峭，說(shuō)明了液料比對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響比NaCl濃度影響更顯著，這與方差分析的結(jié)果(表3)一致。由圖6-b可知，當(dāng)NaCl濃度為1.00 mol/L時(shí)，與液料比的變化曲面相比，pH的變化曲面更平緩，說(shuō)明液料比較pH對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響更顯著，這與方差分析結(jié)果(表3)一致；在pH 4.00～6.00范圍內(nèi)液料比的響應(yīng)曲面比pH 6.00～8.00的范圍內(nèi)液料比的響應(yīng)曲面更陡峭，說(shuō)明在pH 4.00～6.00范圍內(nèi)，液料比對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響更為明顯。等高線圖可以看出兩因素間交互作用的顯著程度，等高線呈圓形表示兩因素間交互作用不顯著，呈橢圓形則表明兩因素間交互作用顯著[26]。

由圖6-c可知，液料比為40∶1時(shí)，pH與NaCl溶液濃度的等高線呈圓形，說(shuō)明pH與NaCl濃度間交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果(表3)一致。

圖6 因素交互作用對(duì)辣木籽蛋白提取率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plots and response surface for the effectof operating parameters on the extractability of protein fromthe defatted Moringa oleifera seed flour

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)軟件分析情況與實(shí)際操作情況確定最終優(yōu)化反應(yīng)條件如下：NaCl濃度為1.10 mol/L，pH為6.30，液料比為60∶1，超聲功率和超聲時(shí)間分別為120 W和15 min，重復(fù)提取2次。為檢驗(yàn)回歸模型方程的可靠性，用上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證得該條件下辣木籽蛋白質(zhì)的提取率為88.09%，與預(yù)測(cè)值88.89%間的相對(duì)誤差為0.90%，說(shuō)明由響應(yīng)面法得到辣木籽蛋白質(zhì)最佳提取工藝是可行的。

2.4 蛋白質(zhì)的純化

NaCl濃度對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)的沉淀率及純度的影響如表4所示。鹽析體系中NaCl濃度從2.56 mol/L增大到4.27 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀率提高了29.31%，且蛋白質(zhì)純度均高達(dá)90.00%以上。在NaCl濃度為4.27 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀率最大(86.80%)，該條件下所得的凍干粉中蛋白質(zhì)純度為96.22%，這說(shuō)明4.27 mol/L的NaCl能沉淀上清液中的大部分蛋白質(zhì)，并且得到的辣木籽蛋白質(zhì)純度較高。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 NaCl濃度對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)沉淀率及純度的影響Table 4 Effect of NaCl concentration on the precipitationrate and purity of Moringa oleifera protein

3 結(jié)論

采用超聲輔助法提取辣木籽蛋白質(zhì)，單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示辣木籽蛋白質(zhì)主要為鹽溶蛋白質(zhì)，且在弱酸性(pH 6.00)條件下更容易被提取。通過(guò)響應(yīng)面分析得到各因素對(duì)辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響作用依次為：液料比>pH>NaCl濃度。在超聲功率為120 W、超聲時(shí)間為15 min時(shí)，液料比為60∶1(mL∶g)、pH為6.30、NaCl濃度為1.10 mol/L條件下重復(fù)提取2次，辣木籽蛋白質(zhì)的最高提取率可達(dá)88.09%。將此條件下所得的上清液在pH為10.00，NaCl濃度為4.27 mol/L的鹽析體系下進(jìn)行鹽析，沉淀率達(dá)86.80%，透析純化后蛋白質(zhì)純度為96.22%。這一系列試驗(yàn)均表明超聲波輔助提取法能夠提高辣木籽蛋白質(zhì)的提取效率。