孫菡崢，孫培冬*

1(食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

龍眼(DimocarpuslonganLour.)是最受歡迎的亞熱帶水果之一，廣泛分布于東南亞和我國(guó)南部[1]。龍眼果肉通常以新鮮或加工的形式食用，而占水果鮮重約17%的龍眼核，被作為廢棄物丟棄或在加工過程中作為燃料燃燒[2-3]。龍眼核作為傳統(tǒng)中藥具有止血、定痛、理氣、化濕的功效，可治療創(chuàng)傷出血、疝氣等[4]。龍眼核提取物含有黃酮類化合物，且對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用[5]；文良娟等[6]發(fā)現(xiàn)龍眼核提取物對(duì)DPPH自由基、OH自由基有良好的清除作用。所以龍眼核含有的多種活性物質(zhì)具有良好的抗菌、抗氧化等生物活性[7-8]。

多酚是在芳環(huán)上含有1個(gè)或多個(gè)羥基的化合物，性質(zhì)活潑[9]，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，這種化合物幾乎存在于所有植物中[10]。龍眼核中含有豐富的多酚類物質(zhì)，研究人員采用溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法提取龍眼核多酚，發(fā)現(xiàn)其對(duì)DPPH自由基、OH自由基有很好的清除作用[11]；龍眼核中含有鞣花酸及其衍生物，具有優(yōu)異的抗氧化性[12]。本文對(duì)龍眼核多酚進(jìn)行分離純化，探究其中的多酚種類與含量，以明確其中的主要抗氧化成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼核，購(gòu)自廣西玉林。干燥后打粉過60目篩備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品鑒定所；柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物有限公司；福林酚試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，98%)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，99%)，上海阿拉丁生物科技有限公司；AB-8型大孔吸附樹脂，上海摩速科學(xué)有限公司；Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠樹脂，美國(guó)GE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海-精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HC-300T2高速多功能粉碎機(jī)，永康市綠可食品機(jī)械有限公司；AX224ZH/E電子天平，常州奧豪斯儀器有限公司；RE-S2AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SB-5200DTD型數(shù)控超聲清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市美特儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)沃特世公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 龍眼核多酚的提取及多酚含量的測(cè)定

多酚含量測(cè)定以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚比色法[13]。準(zhǔn)確吸取待測(cè)溶液0.5 mL，加入2.5 mL稀釋10倍的福林酚溶液，搖勻靜置5 min。再加入75 mg/mL Na2CO3溶液2 mL，搖勻后靜置2 h，于760 nm處測(cè)吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，mg/mL)、吸光度為縱坐標(biāo)(y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=0.010 97x+0.005 89，R2=0.999 2。

精確稱取1 g預(yù)先干燥、粉碎過篩的龍眼核粉末置于圓底燒瓶中，加入乙醇水溶液，采用超聲波輔助法提取多酚。收集濾液，并用去離子水于1 000 mL容量瓶中定容，用上述方法測(cè)定多酚含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液多酚含量，然后按公式(1)計(jì)算多酚提取量(mg/g)：

(1)

式中：V1，提取液定容體積，mL；ρ，多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；m0，龍眼核粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 龍眼核多酚提取條件優(yōu)化

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇：準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末1 g，料液比1∶20(g∶mL)、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%條件下龍眼核多酚提取量。

(2) 料液比的選擇：準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末1 g，乙醇體積60%，提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃，考察料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶mL)條件下龍眼核多酚提取量。

(3)提取溫度的選擇：準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末1 g，乙醇體積60%，提取時(shí)間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，考察提取溫度為40、50、60、70、80 ℃條件下龍眼核多酚提取量。

(4)提取時(shí)間的選擇：準(zhǔn)確稱取龍眼核粉1 g，乙醇體積60%，提取溫度60 ℃，料液比1∶20(g∶mL)，考察提取時(shí)間為15、30、45、60、75 min條件下龍眼核多酚提取量。

1.3.3 龍眼核多酚的分離純化

1.3.3.1 有機(jī)溶劑萃取

準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末25 g，用上述最優(yōu)提取條件提取。提取液減壓濃縮至約50 mL后，依次用約200 mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取。每種溶劑萃取3次，合并后減壓濃縮，并冷凍干燥得到粉末。稱重后計(jì)算3種萃取相得率并按1.3.1測(cè)定多酚含量。

1.3.3.2 大孔吸附樹脂分離

將乙酸乙酯相冷凍干燥粉末配制成質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，pH值3.5的溶液。然后將已經(jīng)處理過的AB-8型大孔樹脂濕法裝柱，去離子水平衡后，以流速1.7 mL/min上樣，共上樣120 mL。待大孔樹脂吸附完全后，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇以相同流速洗脫，分管收集，每管13 mL。按1.3.1測(cè)定計(jì)算每管的多酚含量，按公式(2)計(jì)算每管的總酚量(mg)。

總酚量=V2·ρ

(2)

式中：V2，每管洗脫液體積，mL；ρ，多酚質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.3.3 葡聚糖凝膠樹脂純化

準(zhǔn)確稱取30 g葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，用20%甲醇水溶液充分溶脹后裝柱。將1.3.3.2大孔樹脂純化物的冷凍干燥粉末配制成20 mg/mL的溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后上樣2 mL。分別用250 mL體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液以1.0 mL/min流速洗脫，分管收集，每管10 mL并在280 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3.4 UPLC-MS分析

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A:100%乙腈；流動(dòng)相B:0.1%甲酸。色譜洗脫條件：0～10 min，流動(dòng)相A從5%增加至25%；10～15 min，增加至40%；15～20 min，增加至80%；10～25 min，增加至100%。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

ESI-；毛細(xì)管電壓，3.0 kV；錐孔電壓，30 V；離子源溫度，100 ℃；脫溶劑氣溫度，400 ℃；脫溶劑氣流量，700 L/h；錐孔反吹氣流量，50 L/h；碰撞能量，6/20 V；探測(cè)器電壓，1 800 V。

1.3.4.3 柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精確稱取柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品，用無水甲醇定容至10 mL，以柯里拉京質(zhì)量濃度(x，μg/mL)與峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=3.321 4x，R2=1。

1.3.5 抗氧化性能測(cè)定

1.3.5.1 ABTS法

用2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液將ABTS配制成濃度為7 mmol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用乙醇將儲(chǔ)備液稀釋至在734 nm處吸光度為(0.700±0.02)的工作液。在96孔板中依次加入190 μL的ABTS工作液和10 μL不同濃度的樣品溶液，搖勻，10 min后于酶標(biāo)儀中測(cè)定波長(zhǎng)734 nm處的吸光度A734。空白組用pH 4.5醋酸緩沖液代替ABTS工作液，對(duì)照組用DMSO代替樣品溶液[14]。按公式(3)計(jì)算ABTS自由基抑制率：

(3)

1.3.5.2 FRAP法

FRAP工作液：pH值3.6醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液按體積比(10∶1∶1)混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。在96孔板中依次加入190 μL的FRAP工作液和10 μL不同濃度的樣品溶液和FeSO4溶液，搖勻，37 ℃孵育10 min，在酶標(biāo)儀中測(cè)量波長(zhǎng)593 nm處的吸光度A593?？瞻捉M用pH 3.6 醋酸緩沖液代替FRAP工作液，對(duì)照組用DMSO代替樣品溶液[15]。以FeSO4的濃度(μmol/L)與吸光度值的關(guān)系做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值，求得相應(yīng)的FRAP值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

由圖1-A可知，隨著乙醇含量的增加，龍眼核多酚提取量呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，多酚的提取量達(dá)到最大值。圖1-B顯示，當(dāng)料液比在1∶10～1∶25(g∶mL)范圍內(nèi)，總酚提取量有顯著增加，但繼續(xù)提高溶劑用量對(duì)多酚提取量無明顯影響。故確定最佳料液比為1∶25(g∶mL)。由圖1-C和1-D可知，隨著提取溫度和時(shí)間的增加，多酚提取量有明顯升高，但繼續(xù)增加，多酚提取量反而會(huì)降低，這是因?yàn)闇囟冗^高或時(shí)間過長(zhǎng)，多酚易發(fā)生氧化。所以選取70 ℃和60 min為提取溫度和時(shí)間。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度、時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration, solid-to-solvent ratio, temperature and time on extraction yield of polyphenols

綜上可知最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25(g∶mL)、溫度70 ℃、時(shí)間60 min。該條件下，龍眼核粉末的多酚提取量為53.68 mg/g。

2.2 分離純化

2.2.1 萃取

表1 3種有機(jī)溶劑萃取相的得率及多酚含量Table 1 Yield and polyphenol content of three organicsolvent extraction phases

為了進(jìn)一步探究龍眼核中的主要多酚，選擇有機(jī)溶劑萃取富集多酚。從表1可以看出，3種有機(jī)溶劑中乙酸乙酯萃取后得到的多酚含量最高，為663.50 mg/g。

2.2.2 大孔吸附樹脂分離與Sephadex LH-20柱純化

通過AB-8型大孔樹脂的吸附與解析作用提高乙酸乙酯相多酚的純度。從圖2可以看出，流出液的多酚主要集中在5～20管中，收集洗脫液并冷凍干燥，進(jìn)行Sephadex LH-20柱分離。洗脫曲線見圖3。根據(jù)洗脫液紫外吸光值分布可以將其分為6個(gè)組分，其中可以明顯的看出具有最高吸光值的組分4為乙酸乙酯相中的主要多酚。組分4的多酚含量為757.75 mg/g，較乙酸乙酯相有較大的提高。

圖2 AB-8型大孔樹脂洗脫曲線Fig.2 AB-8 type macroporous resin elution curve

圖3 Sephadex LH-20樹脂洗脫曲線Fig.3 Sephadex LH-20 resin elution curve

2.3 UPLC-MS分析

圖4-A和圖4-C分別為組分4和柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC圖，組分4主要峰的保留時(shí)間與柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致。

A-組分4的UPLC圖；B-組分4的質(zhì)譜圖；C-柯里拉京的UPLC圖；D-柯里拉京的質(zhì)譜圖圖4 組分4與柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS圖Fig.4 The UPLC-MS of component 4 and corilagin

對(duì)比圖4-B和圖4-D中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并與PFUNDSTEIN等[16]的研究數(shù)據(jù)比較，確定組分4中的主要多酚物質(zhì)為柯里拉京(corilagin)，分子式為C27H22O18。根據(jù)1.3.4.3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到組分4的柯里拉京含量為631.18 mg/g。

2.4 抗氧化性能的測(cè)定

通過測(cè)定ABTS自由基清除能力和FRAP值評(píng)估龍眼核多酚的抗氧化能力。ABTS法基于ABTS自由基的減少來檢測(cè)抗氧化劑的抗氧化能力[17]。FRAP法是利用Fe3+被抗氧化物質(zhì)還原成Fe2+，通過檢測(cè)Fe2+-TPTZ的生成量反映抗氧化物質(zhì)的還原能力，F(xiàn)RAP值越大則抗氧化能力越強(qiáng)[18]。從圖5-A可以看出，ABTS自由基清除能力的大小為：組分4>乙酸乙酯相>VC>粗提物相>正丁醇相>氯仿相。從圖5-B中顯示的FRAP值大小為：組分4>VC>乙酸乙酯相>粗提物相>正丁醇相>氯仿相。綜上所述，組分4具有優(yōu)于VC的抗氧化能力。且抗氧化能力隨多酚含量提高而上升，說明龍眼核中的主要抗氧化成分為多酚。

圖5 龍眼核多酚的ABTS自由基的抑制率與FRAP值Fig.5 Inhibition rate of ABTS free radicals and FRAP values of polyphenols in longan seeds

3 結(jié)論

本文以來源豐富的龍眼核為原料，優(yōu)化超聲波輔助法提取龍眼核多酚，最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25(g∶mL)、溫度70 ℃、時(shí)間60 min。在此提取條件下，龍眼核多酚提取量為53.68 mg/g。通過有機(jī)溶劑萃取、AB-8型和Sephadex LH-20型樹脂的分離與純化，得到乙酸乙酯相主要的多酚組分4。通過液質(zhì)聯(lián)用與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照確定其中主要多酚為柯里拉京，含量為631.18 mg/g。比較ABTS自由基的清除能力與FRAP值，確定了多酚含量較高的組分4具有較強(qiáng)的抗氧化性。