姚艷艷，劉心田，常麗榮*，錢浩，王曉輝，車建鋒，李長青

1(威海長青海洋科技股份有限公司，國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心，山東 榮成，264300) 2(威海市漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東 威海，264200)

海帶(LaminariajaponicaAresch)是一種重要食品、肥料、飼料及工業(yè)原料，有著很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年，我國經(jīng)濟(jì)海藻養(yǎng)殖總量達(dá)223.5萬t，其中海帶(鮮品)年產(chǎn)量達(dá)148.7萬t[1]。而目前國內(nèi)對海帶的加工方式還是以自然曬干、烘干、鹽漬等簡單加工為主，無論哪種方式，都面臨著環(huán)境污染嚴(yán)重、高耗能、勞動(dòng)密集、附加值低等嚴(yán)峻問題。

近年來，海帶提取物相關(guān)技術(shù)、產(chǎn)品陸續(xù)涌現(xiàn)，尤其是在農(nóng)業(yè)[2]、食品[3]、化妝品[4]、保健品[5]、醫(yī)藥[6]等領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。工業(yè)上，海帶的提取加工方法主要有化學(xué)法、物理法、生物法等[7-8]?；瘜W(xué)法和物理法存在能耗高、污染環(huán)境的缺點(diǎn)；而生物發(fā)酵降解技術(shù)是利用微生物產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等來降解藻體，是海帶提取加工產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新應(yīng)用，具有反應(yīng)條件溫和、節(jié)約能耗、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，是海帶及其他經(jīng)濟(jì)海藻提取加工的新技術(shù)。目前，國內(nèi)外對海帶的生物降解方法仍以生物酶解技術(shù)為主[9-10]，存在降解得率低、資源浪費(fèi)大、酶制劑成本高等問題。只有少量文獻(xiàn)報(bào)道利用復(fù)合菌株對海帶進(jìn)行發(fā)酵降解[11-12]，而已報(bào)道的產(chǎn)酶菌株種類較少，且產(chǎn)酶較單一，產(chǎn)酶能力低[13-15]，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。

皺紋盤鮑主要以海帶為食，其腸道內(nèi)含有多種益生菌及產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株[16-18]，但從鮑魚腸道內(nèi)篩選應(yīng)用于降解海帶的微生物尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)從鮑魚腸道中，以篩選產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)一步篩選能夠?qū)нM(jìn)行發(fā)酵降解的海洋源菌株，最大程度地提取和利用以褐藻膠為主的海帶有效成分，提高海帶降解得率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟鮑魚：威海長青海洋科技股份有限公司；褐藻膠裂解酶：1 000 U/mL，國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心；復(fù)合酶：20 000 U/mL，諾維信創(chuàng)新與發(fā)展中心；血液瓊脂基礎(chǔ)，脫纖維羊血：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

褐藻酸鈉，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，(NH4)2SO4，KH2PO4，K2HPO4，蛋白胨，酵母粉，可溶性淀粉，F(xiàn)ePO4，KCl，CuSO4，MgCl2：分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；L535-1低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV2800S紫外分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，HFsafe-1200生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；DHZ大容量恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；STTIK高壓滅菌鍋，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；BIOER XP基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；SC80S凝膠成像系統(tǒng)，上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5 g，蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，過濾海水1 000 mL，調(diào)節(jié)初始pH至7.2，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO43 g，K2HPO47 g，NaCl 30 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)初始pH至7.0，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：見參考文獻(xiàn)[19]。

血平板：配制100 mL的血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基于121 ℃滅菌15 min，冷卻至50 ℃，無菌操作加入10 mL無菌的脫纖維羊血，搖勻，傾注平板，凝固后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白酶培養(yǎng)基：脫脂奶粉30 g，瓊脂15 g，陳海水1 000 mL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH至7.6，121 ℃滅菌20 min。

淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基：見參考文獻(xiàn)[20]。

1.4 菌株的篩選

1.4.1 菌種富集及初篩

取鮮活的鮑魚腸道作為實(shí)驗(yàn)樣品，用研缽研磨后，加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于25 ℃下富集培養(yǎng)16 h，將富集后的樣品梯度稀釋至10-4，取各梯度下樣品100 μL涂布篩選培養(yǎng)基，25 ℃下培養(yǎng)2～5 d。

1.4.2 溶血素的產(chǎn)生

將2216E培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的待測菌株點(diǎn)種于血平板上，25 ℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落周圍的溶血圈情況，來判斷溶血素的產(chǎn)生。

1.4.3 產(chǎn)酶能力篩選

用接種環(huán)挑取純化后的菌株單菌落，分別點(diǎn)種于蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)24～48 h。菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌株為陽性，不產(chǎn)透明圈的菌株為陰性。

淀粉酶培養(yǎng)基顯色：輕輕刮下菌苔，用蒸餾水或1 mol/L NaCl溶液沖洗培養(yǎng)基表面，用盧戈氏碘液染色5 min。

纖維素酶培養(yǎng)基顯色：輕輕刮下菌苔，用蒸餾水或1 mol/L NaCl溶液沖洗培養(yǎng)基表面，用0.1%剛果紅染液染色30 min，再用1 mol/L NaCl溶液洗脫1～2次，每次浸泡20 min。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 菌株菌落形態(tài)觀察

菌株在篩選平板上25 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察平板上菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5.2 16S rRNA分子鑒定

以提取菌株的總DNA為模板，以27F和1 492R為引物[21]，進(jìn)行Touchdown-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，共進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；再進(jìn)行94 ℃變性30 s，45 ℃下退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。凝膠回收目的片段后，送樣測序。

將得到的測序結(jié)果在EzBioCloud網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對，并找出與之同源性接近的不同菌株序列，應(yīng)用MeGA 5.0軟件進(jìn)行聚類與同源性分析。遵循鄰接法(neighbor-joining method)原則，并通過自舉分析(boostrap)進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次，構(gòu)建分支系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 褐藻膠裂解酶酶活力的測定

25 mL比色管中加入2 mL含1.5% NaCl的0.5% 褐藻酸鈉溶液，在30 ℃水浴中放置10 min，再加入10～100 μL酶液，振蕩混勻后于30 ℃水浴中反應(yīng)30 min，加入3 mL DNS試劑混勻，沸水浴5 min后立即冷卻至室溫，定容至25 mL，在540 nm處檢測光吸收值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)生還原糖的量。酶活力單位定義為：30 ℃下每分鐘產(chǎn)生1 μg的還原糖所需要的酶量。發(fā)酵液酶活力定義為：1 mL發(fā)酵液含酶活單位(U/mL)。

1.7 菌體生長和產(chǎn)酶曲線的繪制

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3次傳代后的菌株，在預(yù)實(shí)驗(yàn)最佳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在菌株生長過程中每間隔5 h取樣1次，測定發(fā)酵液的OD600值及酶活力值大小，繪制出菌株的生長和產(chǎn)酶曲線。

1.8 褐藻膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)研究

利用硫酸銨分級鹽析法制備粗酶，并用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)溶解。

最適溫度的測定：在25、30、35、40、45、50 ℃下測定酶活力，其中底物濃度5‰，反應(yīng)pH 7.0。

最適pH的測定：在pH 6.5、6.8、7.0、7.3、7.5、8.0、8.5下測定酶活力，其中底物濃度5‰，酶解溫度是35 ℃。

金屬離子對酶活力的影響：在反應(yīng)體系中加入K+(KCl)、Fe2+(FeSO4·7H2O)、Cu2+(CuSO4)、Na+(NaCl)、Mg2+(MgCl2)、Ca2+(CaCl2)下測定酶活力，其中底物濃度5‰，酶解溫度是35 ℃，反應(yīng)pH 7.5。

1.9 海帶降解得率

選取100目海帶粉，海帶粉與水的料液質(zhì)量比為1∶12，在菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶最佳酶解條件下，利用菌株發(fā)酵液、褐藻膠裂解酶、復(fù)合酶對海帶發(fā)酵降解6 h，并計(jì)算海帶降解得率。

海帶降解得率是指干海帶發(fā)酵后溶于水中的可溶性固形物占干海帶的百分含量，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：w，海帶發(fā)酵得率，%；c，海帶發(fā)酵上清液的可溶性固形物的百分含量，%；m，發(fā)酵后所得海帶發(fā)酵上清液質(zhì)量，g；m0，發(fā)酵用的干海帶質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶降解菌株的篩選

通過以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基初篩，從鮑魚腸道中篩選得到100多株菌，其中有12株是產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，通過搖床振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，測定不同菌株發(fā)酵上清液的酶活力大小，結(jié)果如表1所示。其中YY7菌株的酶活力最高，且經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，其遺傳穩(wěn)定性及產(chǎn)酶活力穩(wěn)定，因此，將此菌株進(jìn)行菌種鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究。

表1 不同菌株產(chǎn)褐藻膠裂解酶活力對比Table 1 The alginate lyase activity in different strains

2.2 菌種的鑒定

菌株YY7在篩選平板上培養(yǎng)48 h后，菌體周圍產(chǎn)生明顯水解透明圈，單菌落呈現(xiàn)不透明圓形，邊緣整齊，顏色微白，直徑約1.5 mm，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，稍有隆起，顯微鏡下觀察為彎桿狀，革蘭氏陰性菌。

通過分子生物學(xué)手段，鑒定菌株YY7的16S rRNA基因序列為1 476 bp，在EzBioCloud網(wǎng)站上經(jīng)過序列比對，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA與弧菌屬Vibrioalgivorus的SA2(T)菌株的相似性最高，為99.72%，依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析(圖1)，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征觀察，初步鑒定為弧菌屬菌株，并命名為Vibriosp. YY7。

圖1 YY7菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequenceof YY7 stains

將YY7菌株點(diǎn)種于血平板上培養(yǎng)，并沒有產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，表明YY7菌株不具有潛在致病性。通過其他培養(yǎng)基鑒定YY7菌株的產(chǎn)酶情況后，發(fā)現(xiàn)YY7菌株在蛋白酶培養(yǎng)基(圖2-a)和淀粉酶培養(yǎng)基(圖2-b)上均有透明圈，說明菌株YY7還具有蛋白酶和淀粉酶活性。水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的篩選大多通過體外篩選產(chǎn)酶菌株獲得[22]，因此推斷YY7菌株可能是鮑腸道內(nèi)的潛在益生菌。

a-蛋白酶培養(yǎng)基; b-淀粉酶培養(yǎng)基圖2 YY7菌株在蛋白酶培養(yǎng)基和淀粉酶培養(yǎng)基的產(chǎn)酶情況Fig.2 The enzyme production of YY7 strains on protease medium and amylase medium

2.3 菌體生長曲線和產(chǎn)酶曲線的繪制

對YY7菌株進(jìn)行生物量監(jiān)測和產(chǎn)褐藻膠裂解酶曲線的繪制，如圖3。由圖3可見，菌體的生長隨時(shí)間的延長逐漸升高，在18 h后開始進(jìn)入穩(wěn)定生長期，菌株生物量接近最大值，酶活力在20 h達(dá)到最高值，為54.31 U/mL，與已報(bào)道的弧菌Vibriosp. QY107[14]、Vibriosp. SS-1[18]等菌株相比，菌株YY7的發(fā)酵產(chǎn)酶周期更短，生產(chǎn)速度較快，在工業(yè)化生產(chǎn)中，極大縮短了發(fā)酵時(shí)間，從而降低雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)約了生產(chǎn)成本，具有極大的生產(chǎn)優(yōu)勢。

圖3 YY7菌株的生長曲線及酶活力曲線Fig.3 Growth curve and enzyme activity curve of YY7 strains

2.4 褐藻膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)溫度的確定

將酶反應(yīng)體系分別置于25、30、35、40、45、50 ℃的水浴中反應(yīng)，測定不同溫度下褐藻膠裂解酶的活力，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著溫度升高，酶活力逐漸升高，35 ℃達(dá)到最高值，40 ℃時(shí)酶活力略有降低，之后溫度越高，酶活力逐漸降低，可能是溫度越高，對酶的破壞越大，從而活力逐漸降低。故該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃。

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.2 褐藻膠裂解酶最適pH確定

酶解反應(yīng)體系中pH是影響酶的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要因素，同時(shí)也影響底物和酶的解離狀態(tài)[23]。為探究反應(yīng)體系pH對褐藻膠裂解酶活力的影響，選取pH 6.5、6.8、7.0、7.3、7.5、8.0、8.5七個(gè)梯度進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，褐藻膠裂解酶活力隨著體系pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，在pH 7.5附近達(dá)到最大值，繼續(xù)增大pH，褐藻膠裂解酶活力反而下降，可能是堿性環(huán)境影響了酶與底物的結(jié)合，也可能是在堿性環(huán)境下酶蛋白的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都遭到了破壞。因此該酶的最適反應(yīng)pH為7.5。

圖5 pH對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

2.4.3 金屬離子對褐藻膠裂解酶酶解反應(yīng)的影響

選取5種金屬離子研究它們對褐藻膠裂解酶活力的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出Na+、Mg2+、K+、Ca2+對酶活力都有不同程度的促進(jìn)作用，此結(jié)果與李麗妍[24]的結(jié)果一致，各金屬離子對酶活力的促進(jìn)作用由高到低依次為Na+>Mg2+>K+>Ca2+，Na+對酶活力的促進(jìn)作用最大，可能與產(chǎn)酶菌株來自高鹽的海洋環(huán)境有關(guān)[24]，且褐藻膠裂解酶對Na+的依賴性較高[25]。而Fe2+和Cu2+對褐藻膠裂解酶活力起抑制作用。因此，在褐藻膠裂解酶的應(yīng)用過程中，可以根據(jù)需求在反應(yīng)體系中添加Na+、Mg2+、K+、Ca2+，提高酶活力。

圖6 金屬離子對酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ion on enzyme activity

2.5 海帶降解效果分析

2.5.1 海帶發(fā)酵過程中總糖及還原糖含量變化

海帶粉與水按1∶12比例攪拌均勻，將反應(yīng)體系pH調(diào)至7.5±0.1后，加入1 000 U發(fā)酵液或酶，于35 ℃下酶解6 h。YY7發(fā)酵液降解海帶過程中總糖及還原糖含量的變化情況見圖7。由圖7可見，海帶在酶解發(fā)酵過程中，反應(yīng)體系中的總糖和還原糖含量逐漸升高，這可能與菌株YY7發(fā)酵液中各種酶的作用有關(guān)，海帶中褐藻膠、海藻淀粉、海藻多糖等大分子物質(zhì)都有可能被部分降解。

圖7 海帶發(fā)酵過程中總糖及還原糖含量變化Fig.7 Content changes of total sugar and reducing sugar during fermentation of Laminaria japonica Aresch

2.5.2 海帶降解得率對比分析

海帶降解得率反應(yīng)海帶降解效果，海帶降解得率對比見圖8。與褐藻膠裂解酶和復(fù)合酶相比，YY7發(fā)酵液對海帶的降解效果最佳，海帶降解得率可達(dá)到65%以上，表明YY7發(fā)酵液對海帶降解具有較好的效果。

圖8 不同酶對海帶降解得率的影響Fig.8 Effect of different enzymes on degradation yield ofLaminaria japonica Aresch

2.5.3 海帶降解前后的顯微結(jié)構(gòu)差異

海帶粉通過YY7發(fā)酵液降解前后，海帶粉的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，結(jié)果見圖9。

圖9 海帶粉降解前后的顯微照片F(xiàn)ig.9 Photomicrographs before and after degradation of kelp powder

從圖9中可以看出，海帶粉降解前，海帶的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較明顯，完整的細(xì)胞結(jié)合較緊密；而海帶粉降解后，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯被降解，完整的細(xì)胞也被分散開。這可能是由于海帶粉經(jīng)過YY7菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶、蛋白酶、淀粉酶等降解后，細(xì)胞間結(jié)合變得松散，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等組織結(jié)構(gòu)也被部分降解。

3 結(jié)論

從皺紋盤鮑腸道中，以褐藻酸鈉為唯一碳源，篩選出產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株12株，其中酶活力最高的是YY7菌株，通過16S rRNA初步鑒定YY7菌株與弧菌屬Vibrioalgivorus的SA2(T)菌株的相似性最高，為99.72%；通過培養(yǎng)基鑒定發(fā)現(xiàn)，YY7菌株不具有溶血性，同時(shí)還產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶。根據(jù)YY7菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線可知，YY7菌株的生長速度快，其褐藻膠裂解酶活力在20 h可達(dá)到最高54.31 U/mL，最適溫度為35 ℃，最適pH 7.5，Na+、Mg2+、K+、Ca2+對褐藻膠裂解酶活力具有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+和Cu2+起抑制作用。最后利用YY7發(fā)酵液對海帶粉進(jìn)行降解處理發(fā)現(xiàn)，海帶降解得率可達(dá)65%以上，降解效果佳。本研究結(jié)果表明，該菌株適合應(yīng)用于海帶的加工利用，對于提高海帶利用率具有非常重要的作用。下一步還將繼續(xù)優(yōu)化YY7菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，并進(jìn)行放大培養(yǎng)，探索其在海帶精深加工的應(yīng)用研究。