查飛，王洲，2，薛正蓮,2*，蔣雪彪，紀國輝

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是一種嗜鹽性細菌，又稱腸炎弧菌，廣泛分布于海水和鹽水湖等含鹽水域，來源于魚、蝦、貝類等海產(chǎn)品[1-2]。其具有條件致病性，可引起食物中毒，是一種重要的食源性病原微生物，會導(dǎo)致以腹瀉、腸痙攣等為主要癥狀的急性腸胃炎，嚴重時可引發(fā)敗血癥導(dǎo)致死亡，尤其是在夏秋季節(jié)[3-6]。除了已報道的溶血素TDH、TRH和腸毒素等致病因子的作用外，生物膜的形成也能夠增強菌株的致病性[7-9]。作為水產(chǎn)品的主要致病菌，副溶血性弧菌在正常的少鹽環(huán)境中難以存活，但是其引發(fā)食物中毒的事件仍頻頻發(fā)生[10]，這與細菌在逆境條件下的生物膜形成有關(guān)。研究表明，即使食品加工過程中經(jīng)過嚴格的清洗消毒工序，在食品接觸表面還可能殘留微生物并形成生物膜[11-12]。

生物膜(biofilm，BF)是微生物細胞附著在載體表面，通過分泌產(chǎn)生的胞外多聚物(extracellular polymeric substances，EPS)，主要是一些胞外多糖、胞外纖維蛋白和脂蛋白等物質(zhì)，將自身包裹其中而形成細菌聚合物，可以增強微生物細胞對不良環(huán)境的抵抗和耐受能力，造成極大的食品安全隱患[13]。同時，生物膜的形成對微生物的抗生素耐受性也具有一定的促進作用，研究表明，副溶血性弧菌具有廣譜耐藥性，對阿莫西林等抗生素的平均耐藥性較其他細菌高50%[14]，其耐藥性的產(chǎn)生與生物膜形成有關(guān)。據(jù)報道，細菌以生物膜形式存在時，耐藥性可增加10～1 000倍[15]，這由于生物膜形成的胞外聚合物將抗生素與微生物細胞隔離，減緩其進入胞內(nèi)的速度。除了改變微生物細胞對環(huán)境的抗逆性外，生物膜的清除難度也促進了微生物的生長繁殖，加重了細菌污染，目前還沒有抑制生物膜形成的有效方法。而表面活性劑作為一類兩性化合物，既含有親水基團，又含有疏水基團，其表面帶有電荷，與帶負電的生物膜相互作用，會影響胞外聚合物的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響生物膜的形成[16]。

目前，關(guān)于細菌生物膜的形成機制研究，多集中于大腸桿菌和銅綠假單胞菌等模式生物，副溶血性弧菌生物膜的形成特性及其防控措施鮮有報道。因此，本文通過對鹽濃度、pH值和幾種不同類型的表面活性劑對副溶血性弧菌生物膜形成的作用分析，確定副溶血性弧菌生物膜的形成條件，并綜合分析不同類型的表面活性劑對生物膜形成的抑制特性，為副溶血性弧菌的生物膜防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株：副溶血性弧菌ATCC17802，本實驗室保藏；

培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、硫檸膽蔗瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)，杭州百思生物技術(shù)有限公司。

其他相關(guān)試劑：胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、酵母粉、葡萄糖、硫酸、苯酚、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、檸檬酸二銨，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

儀器：ZQZY-BG搖床，上海知楚儀器有限公司；1510全波長酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

TSB培養(yǎng)基：溶解30 g粉末于1 000 mL水中，調(diào)節(jié)到不同pH值，分裝，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 副溶血弧菌的活化培養(yǎng)及菌液制備

從TSB斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體，轉(zhuǎn)接至5 mL 3% NaCl的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～16 h，再移取200 μL培養(yǎng)菌液至新鮮的5 mL 3%NaCl TSB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3 微孔板法

以有蓋的無菌24孔細胞培養(yǎng)板進行菌株生物膜的培養(yǎng)，每孔中先加入2.5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基，再接入500 μL菌液，平行3次。并以TSB培養(yǎng)基作陰性對照。37 ℃培養(yǎng)72 h后，緩緩移去孔中的培養(yǎng)物，并且每孔用蒸餾水清洗2～3次，晾干后加入3 mL 0.1%結(jié)晶紫溶液進行染色，室溫靜置20 min，倒掉染色劑后再以蒸餾水清洗2～3次，洗去浮色，倒置晾干20 min，除去殘余水分，再加入2 mL 33% 乙酸脫色 10 min，并測定OD570nm值。

通常采用OD570nm值來反映生物膜與接觸面黏附的牢固程度，為了實驗結(jié)果的比較分析，以陰性對照孔的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為界定值(ODC)，可對生物膜進行分類:OD≤ODC為無黏附(-)，ODC4ODC為強黏附(+++)[17]。

1.2.4 培養(yǎng)基pH值和NaCl含量對副溶血性弧菌成膜的影響

配制不同質(zhì)量分數(shù)(0、1%、3%、5%)的NaCl溶液和不同pH值(6、7、8、9)的TSB培養(yǎng)基，平行3次，37 ℃培養(yǎng)72 h后，按照方法1.2.3進行實驗。

1.2.5 培養(yǎng)溫度對副溶血性弧菌成膜的影響

在確定培養(yǎng)基pH值和NaCl含量對菌株成膜性能的前提下，分別在不同溫度條件下(4、25、37 ℃)進行菌株的成膜培養(yǎng)，平行3次，按照方法1.2.3進行實驗。

1.2.6 不同表面活性劑對副溶血性弧菌成膜的影響

分別配制十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和檸檬酸二銨母液，然后在24孔中分別加入不同質(zhì)量濃度的上述3種表面活性劑(表1)，將孔板在37 ℃下靜置培養(yǎng)72 h，測定OD570nm值,如式(1)所示。

(1)

表1 不同表面活性劑的終質(zhì)量濃度Table 1 Final concentrations of different surfactants

1.2.7 SDS對副溶血性弧菌生長的影響

采用96 孔板測定SDS的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，分別在96孔板中加入SDS母液與培養(yǎng)基混合至終濃度，見表1，每個孔板接10 μL菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以不加SDS的培養(yǎng)基作對照，測定OD600nm值。

1.2.8 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、200、400、600、800 μL，分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補水至2 mL，加入苯酚2 mL，混勻1 min，小心加入濃硫酸10 mL，再混勻1 min，置沸水浴15 min，冷卻后測定OD490nm的值，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.2.9 胞外多糖的測定

吸取10 mL培養(yǎng)液至50 mL離心管中，離心取上清液，加入等體積的無水乙醇，混勻5 min，4 000 r/min離心15 min，棄去上清，沉淀用10 mL水溶解，吸取2 mL按照1.2.8的方法測定OD490nm值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取葡萄糖含量，計算樣品中胞外多糖的的質(zhì)量濃度[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和NaCl質(zhì)量分數(shù)對副溶血性弧菌生物膜形成的影響

由表2可知，在不同的培養(yǎng)基、pH值及NaCl質(zhì)量分數(shù)條件下，副溶血性弧菌的成膜特性具有明顯差異，只有在特定條件下才能夠形成生物膜。其中，在NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%時，pH 6和pH 7的條件下以及NaCl質(zhì)量分數(shù)5%、pH 8的條件下均能形成中等黏附的生物膜。在NaCl質(zhì)量分數(shù)3%、pH 9的條件下能形成強黏附性生物膜，可能是因為該條件為副溶血性弧菌的培養(yǎng)最佳條件，其菌濃達到最高，大大促進了其生物膜的形成。其他鹽濃度和pH條件下的生物膜無黏附。

表2 不同pH值和NaCl含量下副溶血性弧菌生物膜的形成Table 2 Formation of VP biofilms at different pH valuesand salt concentrations

注：括號中為測定生物膜時的3組平行實驗的平均菌濃OD600nm。

細菌生物膜的形成包括定殖、成熟和脫落釋放等過程，定殖階段涉及細胞對介質(zhì)的黏附以及細胞間的黏附等，與細胞膜的特性有關(guān)。副溶血性弧菌是一類陰性嗜鹽菌，對培養(yǎng)基中的鹽濃度要求較高，Na+對于嗜鹽菌細胞壁結(jié)構(gòu)完整性有重要意義[19-20]。過高或過低的Na+濃度都會影響菌株的正常生長。同時，環(huán)境pH值也會對細胞膜表面的電荷變化產(chǎn)生影響，從而影響生物膜形成初期的粘附過程。本研究發(fā)現(xiàn)，3%質(zhì)量分數(shù)的NaCl條件下，菌株的生長較好，生物膜測定時菌體OD值較高(表2)。另一方面，在pH 9的條件下，細胞膜表面大量負電荷的積累也促進了生物膜的形成和穩(wěn)定。

2.2 不同溫度下副溶血性弧菌生物膜形成

由圖2可知，隨著溫度的升高，不同鹽濃度和pH條件下的生物膜形成量也不斷升高。在4 ℃下，該菌株生物膜形成量最低，生物膜形成明顯受到抑制，與文獻報道一致，低溫會抑制生物膜的形成[21]，這與菌體在低溫情況下的生長和代謝速率較低有關(guān)。同時，研究結(jié)果表明，37 ℃下不同NaCl質(zhì)量分數(shù)與培養(yǎng)基pH條件下的生物膜形成均較好。且在37 ℃溫度條件下，質(zhì)量分數(shù)3%NaCl和pH 9是副溶血性弧菌形成最適條件，因此，在后續(xù)生物膜培養(yǎng)和分析實驗中均采用此條件進行培養(yǎng)。

圖2 不同溫度下副溶血性弧菌生物膜的形成Fig.2 Formation of VP biofilms at different temperatures

2.3 SDS對副溶血性弧菌生物膜影響

在對副溶血性弧菌生物膜形成條件分析的基礎(chǔ)上，對表面活性劑影響生物膜形成的特性進行分析。

首先，對SDS在生物膜形成中的作用進行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同SDS質(zhì)量濃度對副溶血性弧菌生物膜形成的影響Fig.3 Effect of different SDS concentrations on biofilm formation of VP

隨著SDS質(zhì)量濃度的增加，該菌株生物膜的形成呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在SDS質(zhì)量濃度小于600 mg/L時，SDS對生物膜的形成具有促進作用，生物膜量隨著SDS質(zhì)量濃度的提高不斷增加，在600 mg/L時達到峰值。當(dāng)SDS質(zhì)量濃度大于600 mg/L時，SDS會抑制副溶血性弧菌的生長，導(dǎo)致其生物膜形成減弱。IZANO等[22]研究了SDS對伴放線放線桿菌生物膜的形成作用，當(dāng)SDS質(zhì)量濃度高于臨界膠束濃度時，SDS會破壞蛋白質(zhì)的折疊，使蛋白質(zhì)變性，從而影響生物膜的形成，對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用。SDS是一種陰離子表面活性劑，低濃度SDS會影響細胞膜的通透性，促進了細胞與細胞間的信號傳遞，同時，利于胞外蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)的分泌，參與到生物膜的形成過程，當(dāng)濃度過高時，在抑制菌株生長的同時，也會使胞外蛋白質(zhì)變性，破壞生物膜的形成。

2.4 PVP對副溶血性弧菌生物膜的影響

由圖4可以看出,隨著PVP質(zhì)量濃度的增加，該菌株生物膜的形成呈先上升后下降趨勢，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度小于600 mg/L時，在一定程度上促進了生物膜的形成，但是沒有SDS的促進作用明顯，在600 mg/L時達到峰值，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度大于600 mg/L時，抑制生物膜的形成。PVP是一種聚乙烯類非離子型表面活性劑，MARSHALL等[23]認為這種表面活性劑的疏水基會影響初始粘附過程中的高聚物的形成，從而使細菌生物膜成分發(fā)生改變，影響生物膜的穩(wěn)定性，通過激光共聚焦顯微鏡圖像顯示，非離子表面活性劑可以將生物膜厚度由5～40 μm減小到5～25 μm。因此，可能是低濃度的PVP改變了細胞的通透性，促進其胞外多糖的分泌，增加生物膜的形成，當(dāng)PVP濃度過高時，其中的疏水基改變了生物膜的成分，影響其穩(wěn)定性，從而抑制其生物膜的形成。

圖4 不同PVP質(zhì)量濃度對副溶血性弧菌生物膜形成的影響Fig.4 Effect of different PVP concentrations on biofilm formation of VP

2.5 檸檬酸二銨對副溶血性弧菌生物膜的影響

由圖5可知，隨著檸檬酸二銨質(zhì)量濃度的增加，可以顯著促進生物膜的形成，且呈梯度增加。檸檬酸二銨是1種兩性離子表面活性劑，其分子中既帶有正電荷，又帶有負電荷，可能是檸檬酸二銨具有非極性固體表面單層吸附的能力，增強了副溶血性弧菌與介質(zhì)的粘附能力，從而促進了副溶血性弧菌生物膜的形成。

1～7：檸檬酸二銨質(zhì)量濃度0、200、400、600、800、1 000、2 000 mg/L；a-副溶血性弧菌生物膜形成情況；b-副溶血性弧菌生物膜形成促進率圖5 不同檸檬酸二銨質(zhì)量濃度對副溶血性弧菌生物膜形成情況和生物膜形成促進率Fig.5 Different concentrations of diammonium citrate on the biofilm formation and promotion rate of biofilm formation of VP by different concentrations of diammonium citrate

2.6 SDS對副溶血性弧菌的MIC

從圖3可以看出，SDS對副溶血性弧菌生物膜的形成影響顯著，進而研究了不同質(zhì)量濃度SDS對副溶血性弧菌生長的影響，由圖6可知，隨著SDS質(zhì)量濃度增加，副溶血性弧菌的生物量會不斷下降，其生長顯著受到抑制，當(dāng)SDS質(zhì)量濃度為600 mg/L，培養(yǎng)時間為24 h時，副溶血性弧菌生物量達到最低，是抑制該菌生長的最低濃度，因此，SDS對該菌株的最小抑菌濃度(MIC)為600 mg/L。

圖6 不同SDS質(zhì)量濃度對副溶血性弧菌生長的影響Fig.6 Effect of different SDS concentrations on VP growth

2.7 副溶血性弧菌胞外多糖的測定

圖7 添加SDS的副溶血性弧菌胞外多糖的測定Fig.7 Determination of extracellular polysaccharides of VP with SDS

由圖7可知，添加了SDS的副溶血性弧菌培養(yǎng)液中，終濃度為600 mg/L時，即最小抑菌濃度，其胞外多糖含量達到41.27 mg/L，而對照胞外多糖含量為28.99 mg/L，其含量是對照的1.42倍。因此，當(dāng)SDS處于臨界膠束濃度時，促進了該菌株胞外多糖的分泌從而顯著促進生物膜的形成。

3 結(jié)論

副溶血性弧菌形成生物膜，增加細胞對環(huán)境的抵抗能力得以殘存，進而污染食品，造成極大的食品安全隱患[24]。細菌生物膜的形成是由起始到逐步成熟、穩(wěn)定再到逐漸老化的動態(tài)過程，副溶血性弧菌生物形成也經(jīng)歷了這3個階段，起始生長階段，菌濃較低，與介質(zhì)的粘附較弱，隨著細胞的生長，菌濃逐漸升高，菌膜逐步成熟，當(dāng)細胞生長到衰亡期，菌膜老化，伴隨胞外多糖分泌減少，菌膜里的菌體逐漸衰亡，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)被破壞進而脫落[25]。

目前，對生物膜的清除方法主要有抗菌劑涂層、多酶清洗劑和表面活性劑等[26]，其中表面活性劑是1種兩性化合物，因其帶有電荷而與生物膜相互作用來達到清除效果，但是，表面活性劑對生物膜的抑制或清除作用具有一定的限制性。因此，本文通過表面活性劑與副溶血性弧菌生物膜的形成作用進行了分析，主要從表面活性劑的種類和用量上展開研究，SDS、PVP、檸檬酸二銨這3種不同類型表面活性劑的影響比較顯著，且呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。結(jié)果表明，副溶血性弧菌在不同的條件下形成生物膜的量也不同，培養(yǎng)條件為37 ℃，3%NaCl、pH 9時，形成生物膜的量最多，高鹽和高溫有助于其生物膜形成。低濃度(小于600 mg/L)的SDS和PVP可以促進副溶血性弧菌生物膜的形成，高濃度的表面活性劑會抑制生物膜的形成，然而隨著檸檬酸二銨濃度升高可以促進生物膜的形成。當(dāng)SDS濃度為副溶血性弧菌的最小抑菌濃度時，即600 mg/L，對其生物膜的促進作用顯著，其胞外多糖含量是對照的1.42倍。本研究結(jié)果為生物膜的消除和食品安全提供了理論基礎(chǔ)，病原微生物形成生物膜殘留在食品加工器械表面因其難以清除而導(dǎo)致食品污染，雖然這3種表面活性劑不能作為食品添加劑直接添加到食品中，但是SDS和PVP可以作為新型清洗劑,對食品器械上殘留的生物膜達到一個較好的清除作用。